DETERMINATION OF OPTIMUM CULTIVATION CONDITIONS FOR SYNTHESIS OF BACTERIOCINS WITH BACILLUS ENDOPHYTICUS AND BACILLUS LICHENIFORMIS STRAINS AND THEIR STABILITY INVESTIGATION
Abstract and keywords
Abstract (English):
Bacteriocins are substances of protein nature which have antimicrobial properties. Due to the wide spectrum of antagonistic activity which bacteriocins of some microorganisms have, they have the potential for being used as components of antibacterial drugs. Due to the widespread problem of antibiotic resistance of many bacterial strains that cause human diseases, the studying of bacteriocins is particularly relevant as they may be an alternative to antibiotics. Despite the popularity of researches devoted to the study of bacteriocins properties in recent years, many bacteriocins have not been discovered yet and this field of research is relevant. Thus the aim our research is determination of the optimum conditions for cultivation of Bacillus endopheticus and Bacillus licheniformis strains producing bacteriocins for increasing the efficiency of their synthesis, and studying the stability of bacteriocins. Optimum conditions for cultivation of Bacillus endopheticus and Bacillus licheniformis strains have been determined. They are the temperatures from 25 to 37 °C and the acidity of the medium from 6.5 to 8.0. The maximum growth of strains is observed at the temperature of 30 °C and pH 6.5. The influence of temperature and pH on bacteriocins sensitivity has been studied. Bacteriocins are proved to be stable at a neutral pH and a temperature not higher than 80 °C. Antagonistic activity of bacteriocins subjected to different temperatures and pH towards Escherichia coli strain has been determined using a disk diffusion method. The research results are valuable for the development of novel medicinal preparations based on bacteriocins.

Keywords:
Bacteriocins, the optimum condition of cultivation, stability, antagonistic activity
Text
Publication text (PDF): Read Download

Введение Впервые антагонистическая активность у бактерий была обнаружена Пастером и Хобертом [1]. Уже тогда были изучены возможности по использованию непатогенных бактерий для лечения дифтерии и сибирской язвы. Позднее объектом исследований стали метаболиты, продуцируемые бактериями. Ученые открыли, что ряд веществ, продуцируемых бактериальными штаммами, обладают ингибирующей активностью. К ним отнесли антибиотики, бактериофаги, бактериоцины и ферменты. Изначально бактериоцины относили к группе коалицинов, для которых свойственным является: узкий спектр антагонистической активности преимущественно по отношению к родственным видам; летальная природа биосинтеза бактериоцинов, приводящая к гибели клетки; способность адсорбироваться на специфичных рецепторах клетки. Так, долгое время отсутствовала информация, позволяющая дать точное определение бактериоцинам, и они не были выделены в отдельную группу с собственной классификацией [2]. В дальнейшем стало уделяться пристальное внимание изучению бактериоцинов. В настоящее время изучено множество представителей бактериоцинов и приведено несколько классификаций этих веществ, которые могут варьироваться в зависимости от вида штамма-продуцента, также описаны структуры, киллерные свойства и механизмы литического действия бактериоцинов. Итак, бактериоцины - это группа гетерогенных антибиотикоподобных веществ белковой природы, которые продуцируются многими бактериальными штаммами и проявляют бактерицидное действие по отношению к представителям филогенетически близких видов, но при этом некоторые виды бактериоцинов обладают более широким спектром действия [3]. Благодаря результатам многочисленных исследований, посвященных изучению природы бактериоцинов, подробно описаны механизмы их действия, придающие им уникальность как одним из самых эффективных природных ингибиторов, что даже позволяет им конкурировать с антибиоти-ками. Механизмы действия бактериоцинов разнообразны, и по мере изучения открываются новые способы влияния бактериоцинов на клетки. Выделяют три основных способа направленного действия бактерицинов против бактериальных клеток. К первому относят образование каналов в цитоплазматической мембране, через которые выходят ионы К+, Н+ [4, 5]. Это является причиной нарушения мембранного потенциала клетки, способствует ухудшению способности клетки поглощать питательные вещества и нарушению всех биохимических процессов, происходящих в клетке. Ко второму способу относят способность бактериоцинов вызывать нуклеазную деградацию нуклеиновых кислот клетки. Молекулярный механизм нуклеазной деградации заключается в образовании одно- и двуцепочечных разрывов ДНК [6], блокировании включения тиамина в молекулу нуклеиновой кислоты, а также ингибировании синтеза ДНК [7]. Кроме разрушения клеточной ДНК, бактериоцины способны вызывать полное ингибирование липидного синтеза бактерий [8]. Следующий способ направленного действия бактериоцинов проявляется в нарушении белкового синтеза клетки, что происходит за счет специфического расщепления рибосомальной 16S РНК. Так, некоторые виды бактериоцинов вызывают нарушение синтеза тРНК и клеточных ферментов [9, 10]. К одному из механизмов действия бактериоцинов на бактеральные клетки относится нарушение синтеза муреина, что, в свою очередь, приводит к разрушению клеточной стенки и вызывает лизис бактерий или образование сферопластов. После обнаружения способности бактериоцинов к направленному подавлению развития некоторых патогенных штаммов проводилось их изучение для лечения инфекционных заболеваний [11]. Несмотря на данные исследования, большее внимание уделялось изучению антибиотиков и потенциал бактериоцинов не был достаточно раскрыт. Стремительное развитие антибиотиков, их широкое разнообразие и популярность использования привели к резкому увеличению антибиотикорезистентных штаммов. Это является серьезной проблемой для современного общества, приводит к появлению новых инфекций, не поддающихся лечению, и к отсутствию возможности лечить уже существующие заболевания. Все это возрождает заинтересованность в изучении бактериоцинов в качестве альтернативы антибиотикам. На сегодняшний день активно ведутся разработки препаратов на основе бактериоцинов. Один из препаратов для местного применения, применяющийся в медицинской практике и содержащий бактериоцины, называется пиолизин [12]. Делаются даже попытки использования бактериоцинов для влияния на полирезистентные штаммы микроорганизмов [13]. Некоторые работы показали эффективность действия некоторых видов бактериоцинов на рост опухолевых клеток [14]. Для повышения эффективности действия бактериоцинов и устранения некоторых недостатков в их применении ведутся разработки генетически модифицированных бактериоцинов [15]. Все вышеперечисленные факторы делают изучение бактериоцинов перспективным направлением современной науки и открывают множество перспектив для их применения. Целью данного исследования является определение оптимальных условий культивирования штаммов Bacillus endophеticus и Bacillus licheniformis для повышения эффективности синтеза бактериоцинов данными штаммами, а также определение стабильности продуцируемых бактериоцинов. Объекты и методы исследований Объектами исследований являлись штаммы Bacillus endophеticus, Bacillus licheniformis, выделенные с поверхности помидора и болгарского перца. Видовую принадлежность штаммов определяли методом секвенирования по гену 16S РНК. В исследовании были использованы следующие реактивы: мясной экстракт, пептон сухой ферментативный, сухой питательный агар (ООО «Лаб-Биомед», Россия); ацетат натрия, дигидрофосфат калия, дигидрофосфат натрия, хлорид натрия, гидроксид натрия (ООО «РеаХим», Россия); уксусная кислота и борная кислота, лимонная кислота (ООО «Компонент-Реактив», Россия); соляная кислота (ООО «Компонент-Реактив», Россия); трис (Applichem, США). На первом этапе исследований осуществляли подбор оптимальных условий для культивирования штаммов. Культивирование штаммов осуществляли в жидкой питательной среде МПБ следующего состава, г/л: мясной экстракт - 12; хлорид натрия - 6; пептон сухой ферментативный - 12. Культивирование штаммов вели при температурах 25, 30, 37 °С и pH 6,0, 6,5, 8,0 в течение 24 ч. Через определенные промежутки времени по оптической плотности культуральной жидкости определяли концентрацию биомассы в мг/см3 по калибровочной кривой. Антимикробную активность бактериоцинов штаммов рода Bacillus определяли диско-диффузионным методом с измерением зоны подавления роста тест-культуры в мм, в качестве тест-культуры использовали штамм Escherichia coli 1753. Выделение бактериоцинов осуществляли по следующей методике. Культивирование штаммов проводили в жидкой питательной среде МПБ в течение 18 ч при температуре (30±2) °С и pH 6,5. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием в течение 30 мин при 4200 об/мин. Осаждение бактериоцинов проводили сульфатом аммония до 90 % от насыщающей концентрации. Разделение осадка и культуральной жидкости осуществляли центрифугированием при 4200 об/мин в течение 40 мин. Осадок растворяли в 20 ммоль ацетатном буфере рН 5,0. Отделяли нерастворимый осадок центрифугированием в течение 30 мин при 4200 об/мин. Затем осадок ещё раз промывали в 20 ммоль ацетатном буфере рН 5,0 и повторно отделяли центрифугированием [16]. Осадок отбрасывали, а полученный в результате двух промывок осадка препарат использовали для определения антимикробной активности. Для изучения свойств бактериоцинов проводили исследование их стабильности под действием температуры и активной кислотности среды. Для изучения влияния температуры на стабильность бактериоцинов препараты бактериоцинов выдерживали при температурах от 20 до 100 °С в течение 30 мин. Для исследования влияния pH к выделенным бактериоцинам прибавляли следующие буферы: цитратный (рН 2,0 и 3,0), ацетатный (рН 4,0 и 5,0), фосфатный (рН 6,0 и 7,0), Tris-буфер и боратный буфер (рН 9,0 и 10,0) и выдерживали при 0 °С в течение суток. Результаты и их обсуждение 1 Для определения температуры, оптимальной для культивирования штаммов и наработки бактериоцинов, проводили исследования зависимости прироста биомассы от температуры. Температуру варьировали от 25 до 37 °С. Результаты представлены на рис. 1-3. Продолжительность, ч 1 2 Рис. 1. Влияние температуры (25±2) °С на концентрацию биомассы исследуемых штаммов: 1 - Bacillus endophеticus; 2 - Bacillus licheniformis Анализируя данные, приведенные на рис. 1, сделали заключение, что при культивировании штаммов микроорганизмов при температуре (25±2) °С у штамма Bacillus endophеticus наблюдалась максимальная концентрация биомассы, ее значение составило 3,36 мг/см3. Для штамма Bacillus licheniformis наибольшая концентрация биомассы составила 2,9 мг/см3. 2 1 Продолжительность, ч Рис. 2. Влияние температуры (30±2) °С на концентрацию биомассы исследуемых штаммов: 1 - Bacillus endophеticus; 2 - Bacillus licheniformis При анализе данных, представленных на рис. 2, сделали заключение, что при осуществлении культивирования при температуре (30±2) °С меньший прирост биомассы наблюдался у штамма Bacillus licheniformis, максимальная концентрация которого достигла значения 3,51 мг/см3. У штамма Bacillus endophеticus максимальная концентрация биомассы составила 3,68 мг/см3 при культивировании в течение 18 ч, затем при продолжении культивирования наблюдалось незначительное уменьшение концентрации. Графики, приведенные на рис. 3, свидетельствуют о том, что при температуре культивирования (37±2) °С максимальные значения концентрации биомассы исследуемых штаммов соответствуют следующим значениям: Bacillus licheniformis - 3,15; Bacillus endophеticus - 3,36 мг/см3. Таким образом, максимальное накопление биомассы при температуре культивирования (37±2) °С обнаружили у штамма Bacillus endophеticus, минимальное - у штамма Bacillus licheniformis. Дальнейшие исследования направлены на изучение влияния активной кислотности среды на прирост биомассы. Исследования проводили при следующих значениях активной кислотности: 6,0; 6,5; 8,0. Культивирование проводили при температуре (30±2) °С в течение 24 ч. Результаты представлены на рис. 4-6. 1 2 Рис. 3. Влияние температуры (37±2) °С на концентрацию биомассы исследуемых штаммов: 1 - Bacillus endophеticus; 2 - Bacillus licheniformis Продолжительность, ч 2 1 Рис. 4. Влияние pH 6,0 на концентрацию биомассы исследуемых штаммов: 1 - Bacillus endophеticus; 2 - Bacillus licheniformis По данным, приведенным на рис. 4, сделали заключение, что при осуществлении культивирования штаммов микроорганизмов при температуре (30±2) °С и активной кислотности среды 6,0 максимальную интенсивность прироста биомассы наблюдали у штамма Bacillus endophеticus, при этом концентрация биомассы составила 3,75 мг/см3, у штамма Bacillus licheniformis концентрация биомассы составила 3,5 мг/см3. По данным, отраженным на рис. 5, можно сделать заключение о том, что при исследовании прироста биомассы при pH 6,5 штамм микроорганизмов Bacillus licheniformis показал наименьший прирост биомассы с соответствующей концентрацией 3,78 мг/см3. Для штамма Bacillus endophеticus максимальное значение концентрации биомассы составило 4,23 мг/см3. Проведя анализ данных, приведенных на рис. 6, сделали вывод, что максимальные концентрации биомассы исследуемых штаммов соответствовали следующим значениям: Bacillus licheniformis - 2,9 мг/см3; Bacillus endophеticus - 3,2 мг/см3. Из вышесказанного следует, что штамм Bacillus licheniformis проявил наименьшую интенсивность роста. 2 1 Продолжительность, ч Рис. 5. Влияние pH 6,5 на концентрацию биомассы исследуемых штаммов: 1 - Bacillus endophеticus; 2 - Bacillus licheniformis 1 Рис. 6. Влияние pH 8,0 на концентрацию биомассы исследуемых штаммов: 1 - Bacillus endophеticus; 2 - Bacillus licheniformis При исследовании влияния температуры и pH на стабильность бактериоцинов определяли антагонистическую активность выделенных бактериоцинов по отношению к тест-культуре E. сoli. Исследование проводили при температурах от 20 до 100 °С. Результаты приведены в табл. 1. Таблица 1 Зависимость зон ингибирования от температуры Штамм микроорганизмов Температура, °С 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Bacillus endophyticus 12 12 12 12 12 11 9 - - Bacillus licheniformis 13 13 13 13 13 13 10 - - По результатам проведенного исследования обнаружили, что бактериоцины штамма Bacillus endophеticus стали терять свою активность при температуре 70 °С. У бактериоцинов штамма Bacillus licheniformis наблюдалось уменьшение антагонистической активности при температуре 80 °С. Полная потеря антагонистической активности у бактериоцинов исследуемых штаммов наблюдалась при температурах 90 и 100 °С, что свидетельствует об отсутствии стабильности бактериоцинов при этих температурах. Для определения стабильности бактериоцинов при различных значениях pH исследовали их способность сохранять антимикробные свойства при pH от 2,0 до 10,0. Для проведения исследования бактериоцины выдерживали в буферах с разной активной кислотностью, использовали следующие виды буферов: цитратный, ацетатный, фосфатный, боратный и трис-буфер. Результаты исследований представлены в табл. 2. Таблица 2 Зависимость зон ингибирования от рН Штамм микроорганизмов pH 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 Bacillus endophеticus - - - 9 10 12 8 - - Bacillus licheniformis - - - 10 12 13 11 - - Анализируя полученные данные, сделали вывод о том, что бактериоцины штаммов Bacillus endophеticus и Bacillus licheniformis не проявили ингибирующей активности при pH от 2,0 до 4,0. По мере повышения pH активность бактериоцинов росла и достигла максимального предела при pH 7,0. В кислой среде бактериоцины стали терять свою активность: при pH 8,0 их активность начала уменьшаться, а при pH 9,0 и 10,0 наблюдалось ее полное отсутствие. Максимальная антимикробная активность бактериоцинов, продуцируемых штаммами Bacillus endophеticus и Bacillus licheniformis, наблюдалась при pH 7,0. Выводы При исследовании оптимальной температуры культивирования штаммов Bacillus endophеticus и Bacillus licheniformis выявили, что наименьший прирост биомассы у исследуемых штаммов микроорганизмов обнаружен при температуре культивирования (25±2) и (37±2) °С. Наибольший прирост биомассы наблюдался при температуре культивирования (30±2) °С. Таким образом, сделали вывод о том, что данная температура являлась оптимальной для культивирования штаммов. При определении оптимальной активной кислотности среды сделали выводы о том, что при pH 6,0 и pH 8,0 у исследуемых штаммов наблюдалась достаточно низкая интенсивность роста, что подтверждалось низкими значениями концентрации биомассы. При проведении культивирования штаммов при pH 6,5 наблюдалась наибольшая концентрация биомассы, что также говорит о наиболее интенсивном росте штаммов микроорганизмов. В связи с вышесказанным pH 6,5 являлось оптимальным для осуществления культивирования штаммов Bacillus endophеticus и Bacillus licheniformis. В связи с тем, что в промежутке от 0 до 18 ч происходил основной прирост биомассы, приняли решение проводить культивирование штаммов в дальнейшем в течение 18 ч. При изучении чувствительности бактериоцинов к воздействию температуры и pH бактериоцины проявили наибольшую стабильность при нейтральной кислотности среды, в кислой среде бактериоцины потеряли свои антимикробные свойства. Бактериоцины штаммов Bacillus endophеticus и Bacillus licheniformis сохраняли свою стабильность при температурах, не превышающих 80 °С. При температуре 80 °С наблюдалась незначительная потеря их активности, и под воздействием температур 90 и 100 °С активность отсутствовала. Определение оптимальных условий культивирования штаммов-продуцентов бактериоцинов позволило определить условия, в которых наблюдается максимальный прирост биомассы и, следовательно, максимальный синтез бактериоцинов. Изучение чувствительности бактериоцинов к действию температур и pH позволило получить информацию об их стабильности. Полученные результаты исследований представляют ценность и могут быть использованы для разработки лекарственных препаратов нового поколения на основе бактериоцинов.
References

1. Charbon et septicemia / L. Pasteur, J. F. Joubert // Soc. Biol. Paris. - 1877. - Vol. 85. - P. 101-115.

2. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria / J. R. Tagg, A. S. Dajani, W. L.Wannamaker // Bacteuological reviews. - 1976. - P. 722-756.

3. Study of biocompatibility and antitumor activity of lactic acid bacteria isolated from the human gastrointestinal tract / A.Y. Prosekov, L.S. Dyshlyuk, I.S. Milentieva, S.A. Sukhikh, O.O. Babich, S.A. Ivanova, V.A. Pavsky, M.V. Shishin, L.V. Matskova // International Journal of Pharmacy and Technology. - 2016. - Vol. 8, № 2. - P. 13647-13661.

4. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa / Y. Michel-Briand, C. Bayss // Biochimie. - 2002. - Vol. 5. - P. 499-510.

5. Colicin crystal structures: pathways and mechanisms for colicin insertion into membranes / S.D. Zakharova, W.A. Cramer // Biochim. Biophys. Acta. - 2002. - Vol. 2. - P. 333-346.

6. Importation of nuclease colicins into E.coli cells: endoproteolytic cleavage and its prevention by the immunity protein / M. Zamaroczy, R.H. Buckingham // Biochimie. - 2002. - Vol. 5. - P. 423-432.

7. Evidence for the role of DNA strand passage in the mechanism of action of microcin B17 on DNA gyrase / O.A. Pierrat, A. Maxwell // Biochemistry. - 2005. - Vol. 11. - P. 4204-4215.

8. Molecular structures and functions of pyocins S1 and S2 in Pseudomonas aeruginosa / Y. Sano, H. Matsui, M. Kobayashi, M. Kageyama // J. Bacteriol. - 1993. - Vol. 10. - P. 2907-2916.

9. The modes of action of colicins E5 and D, and related cytotoxic tRNases / H. Masaki, T. Ogawa // Biochimie. - 2002. - Vol. 5. - P. 433-438.

10. Ton-dependent colicins and microcins: modular design and evolution / V. Braun, S.I. Patzer, K. Hantke // Biochimie. - 2002. - Vol. 5. - P. 365-380.

11. Treatment of experimental Escherichia coli infection in mice with colicine V / H.W. Smith, M.B. Huggins // J. Med. Microbiol. - 1977. - Vol. 4. - P. 479-482.

12. Gol'dina, O.A. Maz' piolizin - effektivnoe sredstvo monoterapii v shirokoy dermatologii / O.A. Gol'dina, Yu.V. Gorbachevskiy // Poliklinika. - 2010. - № 2. - C. 104-109.

13. A predicted S-type pyocin shows a bactericidal activity against clinical Pseudomonas aeruginosa isolates through membrane damage / H. Ling, N. Saeidi, B.H. Rasouliha, M.W. Chang // FEBS Lett. - 2010. - 584. - Vol. 15. - P. 3354-3358

14. Antineoplastic properties of bacteriocins: revisiting potential active agents / G. Cornut, C. Fortin, D. Soulières // Am. J. Clin. Oncol. - 2008. - Vol. 4. - P. 399-404.

15. Genetically engineered bacteriocins and their potential as the next generation of antimicrobials / O. Gillor, L.M. Nigro, M.A. Riley // Cur. Pharm. Des. - 2005. - Vol. 8. - P. 1067-1075.

16. Lucenko, N.G. Nachala biohimii: kurs lekciy / N.G. Lucenko; RHTU im. D.I. Mendeleeva. - M.: MAYK «Nauka/Interperiodika», 2002. - 124.