INNOVATION MANAGEMENT BIOTECHNOLOGY OF STARTER CULTURES
Abstract and keywords
Abstract (English):
According to experts, one of the innovative directions of the development of food biotechnology is the development of biotechnological approaches to the production of probiotics, prebiotics, synbiotics, ferments and food ingredients, new strains of lactic acid and other technological microorganisms, microbial consortia with predetermined biological properties and optimized processing characteristics. The inclusion of polycomponent probiotic consortia - bacterial preparations from cultures of lactic acid bacteria - into foods can be the basis for the prevention of various diseases. Experts predict the start of production of probiotic products with proven efficiency in Russia by 2017 and their mass production by 2020. The use of lactic acid bacteria as starter cultures of direct application and having necessary range of features will improve the functional-and-technological and consumer properties of dairy products. The paper deals with the study of physiological-and -biochemical and commercially valuable properties of strains of lactic acid bacteria when creating combined starter cultures of direct inoculation with high proteolytic activity. It has been found that the lactic acid bacteria of Lactococcus lactis subspecies cremoris B 2276, Lactobacillus plantarum B 3242, Lactococcus lactis B 5946 and Leuconostoc mesenteroides subspecies mesenteroides B 8404 have high proteolytic activity contributing to the formation of low molecular weight peptides and free amino acids in milk and show high antagonistic activity against sanitary significant intestinal microorganisms (Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Escherichia coli) . The results on the study of biocompatibility show the lack of inhibitory effect which allows their use in preparing the combined starter of direct inoculation.

Keywords:
Innovative foods, starters of direct inoculation, proteolytic activity
Text
Publication text (PDF): Read Download

Введение Важнейшей составной частью современного менеджмента становятся инновации - процесс постоянного обновления во всех сферах предприни- мательства. Структура российской экономики в последнее время претерпевает существенные изменения. Наряду с экспортно-ориентированными сы- рьевыми отраслями промышленности приоритет отдается предприятиям, производящим наукоем- кую продукцию. Хотя последних и незначительное количество, но наблюдается тенденция к увеличе- нию их доли в структуре российской экономики. Этому способствует грамотная государственная политика в области инноваций [1]. Согласно американским оценкам, по своему экономическому потенциалу биотехнологии зани- мают второе место после информационных техно- логий. К 2025 г. они, вероятно, будут обеспечивать до 20 % ВВП. Интенсивное развитие биотехноло- гий обусловлено не только успехами биохимии и молекулярной биологии, но и кризисом традицион- ных технологий, необходимостью обеспечения продовольственной безопасности, сохранения ре- сурсного потенциала, увеличения продолжительно- сти жизни населения, поддержания здорового ге- нофонда нации. Наличие серьезных научных заделов и опытных разработок даст возможность уже в ближайшие годы существенно расширить масшта- бы использования биотехнологий для массового производства продукции с новыми свойствами [2]. Как показывает анализ, в ближайшее время био- технологии будут наиболее востребованы в сель- ском хозяйстве, пищевой промышленности, произ- водстве химикатов и биотоплива. Биотехнологические процессы получения био- логически активных соединений, основанные на направленной модификации путей метаболизма организма-продуцента методами метаболической инженерии, интенсифицируют производство ами- нокислот, витаминов, антибиотиков, ферментов, рекомбинантных белков и др. Значительно более высокая эффективность новых методов метаболи- ческой инженерии и биоинженерии по сравнению с традиционными способами (случайным мутагене- зом и др.) приводит к снижению стоимости продук- та и тем самым обеспечивает условия для его мас- сового применения в различных отраслях [3]. Передовые позиции в разработке радикальных инновационных продуктов и услуг принадлежат ученым из США, Европы и Японии. В частности, в США активно развивается область генетической инженерии растений. Исследования, направленные на создание биотехнологических сортов без ис- пользования трансгенеза и биотехнологических процессов получения рекомбинантных белков в растениях и животных, развиваются более интен- сивно в европейских странах. Уровень российских исследований по большинству радикальных био- технологических продуктов серьезно уступает ми- ровому, однако существует ряд отечественных раз- работок, востребованных за рубежом (например, генно-инженерные штаммы - продуценты амино- кислот и витаминов). По оценкам экспертов, одним из инновационных направлений развития пищевой биотехнологии является разработка биотехнологических подходов к производству пробиотиков, пребиотиков, синбиоти- ков, заквасок и пищевых ингредиентов, новых штаммов молочнокислых и других технологических микроорганизмов, микробных консорциумов с за- данными биологическими свойствами и оптимизи- рованными технологическими характеристиками [4]. В 2015 г. на конгрессе Федерации европейских микробиологических обществ (FEMS) была выдви- нута концепция о включении в состав продуктов питания поликомпонентных пробиотических кон- сорциумов. При регулярном использовании про- биотики регулируют и стимулируют пищеварение, усиливают иммунитет, повышают колонизацион- ную резистентность кишечника, предотвращают развитие аллергических осложнений. Эффектив- ность поликомпонентных пробиотических консор- циумов зависит от многих факторов, в том числе физиологических особенностей человека, наличия хронических и острых заболеваний и др. Эксперты прогнозируют к 2017 г. начало вы- пуска в России продуктов с доказанной пробиоти- ческой эффективностью, а к 2020 г. - их массовое производство. Исследователи по всему миру ведут поиск новых штаммов молочнокислых бактерий с целью создания на их основе более активных про- биотических препаратов, причем для регулярного потребления, то есть в составе продуктов питания. Включение в состав продуктов питания поли- компонентных пробиотических консорциумов - бактериальных препаратов из культур молочнокис- лых бактерий - может стать основой для профилак- тики различных заболеваний. Целью работы является создание симбиотиче- ского консорциума молочнокислых бактерий, об- ладающих наибольшей протеолитической актив- ностью, для использования в составе комбиниро- ванной закваски прямого внесения для получения кисломолочных продуктов. Объекты и методы исследований В качестве объектов исследований использова- ны штаммы молочнокислых бактерий, относящихся к родам Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, предоставленных ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика». Молочнокислые бактерии культивировали на стерильном обезжиренном молоке, соответствую- щем требованиям ГОСТ Р 52090-2003. Сквашива- ние проводили в термостате при температурах, оп- тимальных для каждого штамма. Определение тит- руемой кислотности осуществляли в соответствии с ГОСТ 3624-92, активной кислотности в соответ- ствии с ГОСТ 26781. Определение протеолитической активности молочнокислых бактерий основано на учете накопления продуктов гидролиза казеина, растворимых в 1,125 М трихлоруксусной кислоте через определенный промежуток времени от начала реакции. Фракционный состав гидролизатов белков мо- лока определяли методом высокоэффективного электрофореза в ультратонком слое полиакриламидного геля. Определение антибиотической активности мо- лочнокислых бактерий осуществляли методом пер- пендикулярных штрихов и методом блоков. Результаты и их обсуждение На основании совокупной оценки физиолого- биохимических свойств молочнокислых бактерий для создания симбиотического консорциума из коллекции ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика» ото- браны следующие штаммы: Lactococcus lactis sub- species cremoris B 2276, Lactobacillus plantarum В 3242, Lactococcus lactis B 5946 и Leuconostoc mesen- teroides subspecies mesenteroides В 8404. При изучении изменения активной и титруемой кислотности в процессе сквашивания молока четырьмя выбранными штаммами молочнокислых бактерий установлено, что в течение шести часов сквашивания наблюдается рост кислотности в среднем в 3,2 раза. Предельная кислотообразующая способность в молоке для этих штаммов составляет (120±1) °Т. Одной из важнейших характеристик, определя- ющих производственную ценность молочнокислых бактерий, является протеолитическая активность. Все более очевидной становится роль протеолитических процессов, осуществляемых молочнокис- лыми бактериями в формировании качественных показателей и биологической ценности кисломо- лочных продуктов. У молочнокислых бактерий обнаружены как внутриклеточные, так и внеклеточные протеазы. Наиболее активный протеолиз наблюдается в ран- ние часы развития культуры, что свидетельствует о том, что белок расщепляется в молоке в основном ферментами растущей клетки. В данной работе изучали протеолитическую активность штаммов молочнокислых бактерий и изменение фракций растворимых азотистых соединений при культиви- ровании на обезжиренном молоке в течение 12 ч (табл. 1). Таблица 1 Протеолитическая активность штаммов молочнокислых микроорганизмов Номер штамма Протеолитическая активность, Е/мг белка Изменение фракций растворимыхазотистых соединений белки, мг/100 г пептиды, мг/100 г аминокислоты,мг/100 г В 3242 1984,0±99,2 157,5±7,8 176,3±7,8 6,7±0,1 В 2276 986,0±49,3 201,8±7,0 78,0±0,4 3,9±0,1 В 5946 1109,0±55,4 183,8±7,8 104,3±0,5 4,3±0,1 В 8404 1344,0±67,9 177,0±7,9 123,8±0,6 5,7±0,1 На основании проведенных исследований установлено, что протеолитическая активность четырех рассматриваемых штаммов молочнокис- лых бактерий находится в диапазоне от 986,0 до 1984,0 Е/мг белка. При этом с увеличением про- теолитической активности отмечается убыль белков и увеличение содержания пептидов и аминокислот. Установлена корреляция между активностью протеолиза и активностью кислотообразования у штаммов мезофильных молочнокислых стрептококков (L. lactis B 5946, L. mesenteroides В 8404, L .lactis B 2276). Наибольшей протеолитической активностью обладает представитель рода Lacto- bacillus - Lactobacillus plantarum В 3242. На рис. 1 и в табл. 2 приведены результаты исследования фракционного состава гидролиза- тов белков молока, образующихся под действием протеолитических ферментов штаммов Lactococcus lactis B 5946, Leuconostoc mesen- teroides subsp. mesenteroides В 8404, Lactobacillus plantarum В 3242 и Lactococcus lactis subsp. cremoris B 2276. Рис. 1. Электрофореграмма гидролизатов белков обезжи- ренного молока, ферментированного молочнокислыми бактериями в течение 12 ч: М - маркер; 1 - Lactococcus lactis B 5946; 2 - Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides В 8404; 3 - Lactobacillus plantarum В 3242; 4 - Lactococcus lactis subsp. cremoris B 2276 Анализ данных рис. 1 и табл. 2 позволяет сде- лать вывод о высокой способности исследуемых штаммов молочнокислых бактерий гидролизовать белки молока до низкомолекулярных фракций (молекулярная масса 20 кДа и менее). При этом на казеиновую фракцию белков обезжиренного мо- лока наибольшее воздействие оказывают фер- ментные системы Lactococcus lactis B 5946, Leuco- nostoc mesenteroides subspecies mesenteroides В 8404 и Lactobacillus plantarum В 3242, а на сыво- роточные белки - Lactococcus lactis subspecies cremoris B 2276. Таблица 2 Молекулярно-массовое распределение белков и пептидов, образующихся при ферментации обезжиренного молока штаммами молочнокислых бактерий в течение 12 ч № п/п Молеку-лярная масса, кДа Относительное содержаниефракций, % B 5946 В 8404 В 3242 B 2276 1 212-118 0,1 0,3 0,1 0,6 2 118-66 0,4 0,8 1,1 1,5 3 66-43 3,5 4,6 3,2 9,8 4 43-29 3,8 5,5 4,6 2,2 5 29-20 36,7 36,3 36,1 41,5 6 20-14 15,9 10,7 9,7 30,4 7 Менее 14 39,6 41,8 45,2 14,0 Характерной особенностью молочнокислых бактерий является подавление роста условно- патогенных бактерий, плесневых грибов и дрожжей и других микроорганизмов. В ходе проведенных экспериментов установ- лено, что исследуемые штаммы молочнокислых бактерий проявляли высокую антагонистическую активность по отношению к санитарно-значимым кишечным микроорганизмам (Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Escherichia coli), образуя зоны подавления роста тест-культур диаметром более 20 мм (табл. 3). Изучение межштаммовых взаимодействий мо- лочнокислых бактерий является важным аспектом для дальнейшей работы по созданию функциональ- ных продуктов питания на их основе. При проявле- нии бионесовместимости или сильного антагониз- ма штаммов по отношению друг к другу возможно влияние на антимикробные свойства микроорга- низмов, что исключает составление консорциума из данных штаммов [7]. Определение биосовместимости осуществля- ли путем совместного культивирования штаммов молочнокислых бактерий на плотной питатель- ной среде при температуре (30±1) °С (рис. 2). Таблица 3 Антагонистическая активность молочнокислых бактерий Номер штамма Диаметр зоны задержки роста, мм Staphylococcusaureus Escherichiacoli Proteusvulgaris B 5946 28,0±1,0 25,0±1,0 20,9±1,0 В 8404 24,0±1,0 28,0±1,0 28,5±1,0 В 3242 20,0±1,0 23,0±1,0 20,6±1,0 B 2276 27,0±1,0 24,0±1,0 23,0±1,0 Рис. 2. Биосовместимость штаммов молочнокислых бак- терий: 1 - L. lactis В 5949 + L. mesenteroides В 8404; 2 - L. lactis B 5946 + L. plantarum В 3242; 3 - L. lactis В 5946 + lactis В 2276; 4 - L. mesenteroides В 8404 + L. plantarum В 3242; 5 - L. mesenteroides В 8404 + L. lactis В 2276; 6 - L. plantarum В 3242 + L. lactis В 2276 Показано, что во всех вариантах зоны перекры- тия капель сливаются без образования четких гра- ниц, что свидетельствует об отсутствии ингибиру- ющего действия L. lactis В 5949, L. mesenteroides В 8404, L. plantarum В 3242, L .lactis В 2276 по отно- шению друг к другу. Высокая степень биосовме- стимости позволяет использовать эти микроорга- низмы для создания симбиотического консорциума для получения комбинированной закваски прямого внесения. Таким образом, на основании проведенных ис- следований установлено, что молочнокислые бак- терии Lactococcus lactis subspecies cremoris B 2276, Lactobacillus plantarum В 3242, Lactococcus lactis B 5946 и Leuconostoc mesenteroides subspecies mesen- teroides В 8404 обладают высокой протеолитиче- ской активностью, способствуя образованию в мо- локе низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот, и проявляют высокую антагонисти- ческую активность по отношению к санитарно- значимым кишечным микроорганизмам (Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Escherichia coli). Результаты изучения биосовместимости пока- зали отсутствие ингибирующего эффекта, что поз- воляет использовать их для приготовления комби- нированной закваски прямого внесения. Использование молочнокислых бактерий в ка- честве заквасочных культур прямого внесения, об- ладающих спектром необходимых характеристик, позволит улучшить функционально-технологи- ческие и потребительские свойства кисломолочных продуктов.
References

1. Innovacionnyy menedzhment / sost. N.M. Cycarova. - Ul'yanovsk: UlGTU, 2009. - 195 s.

2. Prognoz nauchno-tehnologicheskogo razvitiya Rossii: 2030. Biotehnologii / pod red. L.M. Gohberga, M.P. Kir- pichnikova. - M.: Ministerstvo obrazovaniya i nauki Rossiyskoy Federacii, Nacional'nyy issledovatel'skiy universitet «Vysshaya shkola ekonomiki», 2014. - 48 s.

3. Novoselova, M.V. Technological options for the production of lactoferrin in E.coli / M. Novoselova. A. Prosekov // Food and Raw Materials. - 2016. vol. 4, no. 1, pp. 90-101. doi: 10.21179/2308-4057-2016-1-90-101.

4. Haritonov, D.V. Razrabotka koncepcii sozdaniya sinbiotikov i sinbioticheskih molochnyh produktov / D.V. Ha- ritonov, I.V. Haritonova, A.Yu. Prosekov // Tehnika i tehnologiya pischevyh proizvodstv. - 2013. - № 4. - S. 91-94.

5. Prosekov, A.J. The rroteolytic activity research of the lactic acid microorganisms of different taxonomic groups / A.J. Prosekov, O.O. Babich, S.J. Noskova, et al. // World Applied Sciences Journal 23. - 2013. - № 23 (10). - S. 1284-1290.

6. Noskova, S.Yu. Vliyanie prodolzhitel'nosti fermentativnogo gidroliza obezzhirennogo moloka i molochnoy sy- vorotki na urozhay kletok molochnokislyh bakteriy / S.Yu. Noskova, O.V. Kriger, V.F. Dolgonyuk // Innovacii v nauke: XVII Mezhdunar. zaoch. nauch.-prakt. konferenciya. - Novosibirsk, 2013. - S. 12-18.

7. Issledovanie antibioticheskoy ustoychivosti i antioksidantnyh svoystv mikroorganizmov zheludochno- kishechnogo trakta / O.O. Babich, L.S. Dyshlyuk, A.Yu. Prosekov, M.V. Shishin // Aktual'nye voprosy nauki. - 2015. - № XVIII. - S. 20-24.