STUDY OF THE QUANTITATIVE CONTENT OF ANIMAL DNA IN SAMPLES OF BIOLOGICAL ORIGIN AND MULTICOMPONENT FORMULATIONS ON THEIR BASIS
Abstract and keywords
Abstract (English):
Examination of biological material samples were conducted to detect the effectiveness of the DNA isolation and purification quality. The optimum high performance method for isolating animal DNA from samples of biological origin and multicomponent compositions on its basis was selected. The quantitative content of animal DNA in samples of biological origin and multicomponent formulations on their basis was studied.

Keywords:
Protein, identification, diagnosis, infection, prion diseases of humans and animals, molecular and biological studies.
Text
Publication text (PDF): Read Download

 

Введение

В последние годы обнаружена группа заболева­ний, характеризующихся прогрессирующим пораже­нием различных отделов нервной системы и имею­щих необычный генетический механизм возникно­вения и развития. На основании сходства морфоло­гического дефекта при этих заболеваниях их объеди­няют в группу спонгиоформных энцефалопатий. Долгое время считалось, что клинические симптомы этих болезней возникают при попадании в организм инфекционного агента, имеющего антигенное срод­ство к нервным клеткам. Предполагалось, что в этом случае запускается механизм иммунного ответа, продолжающийся и после исчезновения из орга­низма инфекционного агента, что приводит к обра­зованию комплекса «антиген-антитело» и гибели нейронов. Вскоре стало ясно, что основная патогене­тическая роль в развитии этих заболеваний принад­лежит белковому агенту, который было предложено называть прионом (PRION – от англ. Proteinaceous Infectious particle, с перестановкой двух букв). В на­стоящее время установлено, что заболевания этой группы имеют двоякую этиологию: первая группа болезней возникает в результате мутации в гене при­онного белка, вторая – обусловлена попаданием в организм человека инфицированного биологиче­ского материала [1].

В группу прионных болезней входят куру, бо­лезнь Крейтцфельдта-Якоба (БКЯ), болезнь Герст­мана-Штросслера и летальная семейная инсомния. Обычно ее описывают совместно с вирусными ин­фекциями центральной нервной системы, но их при­рода совершенно другая – они вызваны накоплением аномальной изоформы прионного белка (PrPSc). Эта изоформа, как и нормальный прионный белок (PrPC), кодируется геном PRNP, расположенным на коротком плече 20-й хромосомы.

Источник инфекционной формы прионов – овцы и козы, у которых спонтанно может развиваться за­болевание, известное под названием «скрэпи». Группа прионных заболеваний животных включает, кроме того, трансмиссивные спонгиоформные энце­фалопатии норок, оленей и лосей, крупного рогатого скота, кошек и собак, антилоп, тигров, гепардов [2].

В мире известно шесть прионных болезней жи­вотных и четыре – человека. Если во второй поло­вине 90-х годов эпизоотическая ситуация стала ста­билизироваться за счет последовательного снижения заболеваемости в Великобритании (от 37 тыс. слу­чаев в 1992 г. до менее 5 тыс. в 1997 г.), то в 2000 г. вновь произошло обострение ситуации за счет воз­росшего неблагополучия в других западноевропей­ских странах, прежде всего во Франции. Случаи «ко­ровьего бешенства», помимо Великобритании, заре­гистрированы в Ирландии, Нидерландах, Франции, Португалии, Швейцарии, Германии, Италии, Омане, Канаде, Дании и на Фолклендских островах. Все эти случаи были связаны с импортом зараженных жи­вотных или зараженной мясокостной муки.

По статистическим данным в России с населе­нием примерно 150 миллионов болезнь Крейтц­фельдта-Якоба ежегодно поражает около 150 чело­век. Однако это не значит, что в отношении прион­ных инфекций у нас все благополучно. Учет таких пациентов ведется плохо: случаи заболевания не вы­являются и не регистрируются, в то время как, на­пример, во Франции создана специальная сеть по надзору, которая отслеживает каждый случай зара­жения БКЯ.

Поэтому на современном этапе является важным налаживание в общегосударственном масштабе работы по регистрации прионных болезней человека и животных на всей территории страны с обращением особого внимания на группы риска (работники ско­товодческих и звероферм, боен, мясокомбинатов и др.) [3].

Одним из сложных вопросов является диагно­стика прионных заболеваний. При этом диагноз ста­вится клинически, а морфологическая диагностика этих болезней проводится на основании исследова­ния биопсийного или аутопсийного материалов. В последние 10 лет произошел значительный прогресс в исследовании молекулярной биологии прионов и диагностике вызываемых ими заболеваний. Созданы трансгенные мыши и модели прионных инфекций в культуре тканей, получены панели моноклональных антител к PrP, созданы системы для диагностики прионных болезней, основанные на различных прин­ципах детекции PrPsc. Разработан ряд коммерческих тест-систем, которые позволяют осуществлять быст­рые и точные анализы аутопсийного материала. С их помощью в странах ЕС производят скрининг всех животных крупного рогатого скота, поступающих на бойни [2, 4].

Важное значение в диагностике болезни Крейтцфельдта-Якоба имеет ЭЭГ-исследование. При этом на ранних этапах болезни наблюдается замедление биоэлектрической активности. Состав цереброспинальной жидкости при прионных болезнях обычно нормальный, воспалительная реакция в ней отсутствует.

В настоящее время самым надежным и достовер­ным методом диагностики БКЯ и других прионных заболеваний является иммуноцитохимический метод выявления в биоптате отложения PrPSc. Инфекцион­ная изоформа PrPSc откладывается в синапсах коры большого мозга и мозжечка, а также в амилоидных бляшках. Отложение PrPSc является наиболее ран­ним этапом в развитии БКЯ и определяется еще до развития структурных изменений в ткани мозга. Од­нако эта методика (иммуноцитохимическое исследо­вание и иммуноблоттинг) находится уже за рамками чисто морфологических методов и требует специальных реактивов и оборудования.

Постоянно увеличивающийся теоретический ин­терес к проблеме обусловлен результатами молеку­лярно-биологических исследований структуры при­онных белков. Уже получен значительный фактиче­ский материал о структуре, функции и накоплении в зараженном организме этих новых и необычных воз­будителей инфекционных заболеваний человека и животных [5, 6].

Результаты последних работ, посвященных коли­чественному определению нормальной формы при­онового белка и его патогенной изоформы в зара­женном материале, свидетельствуют о том, что уро­вень чувствительности подобного теста должен со­ответствовать нескольким атоммолям. Очевидно, на современном этапе перспективными для разработки преклинической диагностики прионных инфекций являются современные методы протеомики и нано­технологий, включая сканирующую зондовую и атомно-силовую микроскопию.

В связи с этим изучение прионового белка и его патогенной изоформы является актуальным вопро­сом для разработки преклинической диагностики, а также развития новых направлений в дальнейших подходах к терапии прионных болезней.

 

Объекты и методы исследований

В работе проведен выбор высокопроизводитель­ного метода выделения животной ДНК из проб био­логического происхождения и многокомпонентных составов на их основе. Выбор объектов исследова­ния обусловлен тем, что продукты переработки крупного рогатого скота используются в различных видах промышленности (медицинской, фармацевти­ческой, пищевой).

В качестве объектов исследования использовали: мозг (усредненная проба серого и белого вещества); цельная кровь; образцы мяса; колбаса вареная; цель­ное молоко; сыр; желатин.

Образцы мозга, мяса и крови отбирали у живот­ных, прошедших ветеринарный контроль, туши были признаны пригодными для употребления в пищу че­ловеком.

Перед выделением ДНК независимо от метода экстракции осуществляли первичную обработку проб исследуемого материала. При анализе мягких материалов, легко поддающихся измельчению (мясо, сыр и пр.), отбирали усредненную пробу продукта массой 1 г, измельчали при помощи стерильных скальпеля, ножниц и одноразового шпателя и гомо­генизировали фарфоровым пестиком в керамической ступке, тщательно перемешивая содержимое.

Пробы сухих сыпучих материалов (желатин) и жидких или полужидких материалов (молоко, кровь и пр.), не требующих измельчения и однородных по составу, при помощи одноразового шпателя или пи­петированием вносили в чистую пробирку типа «Эп­пендорф» в количестве 100–150 мкл по насыпному объему (5–7 мм от дна пробирки). Для предотвраще­ния перекрестной контаминации инструменты для измельчения материала использовали однократно, тщательно мыли и стерилизовали после использова­ния или при переходе от пробы к пробе.

Концентрацию ДНК в образцах оценивали спек­трофотометрическим методом и рассчитывали по формуле

 

,

 

где Сднк – концентрация ДНК; OD260 – оптическая плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм.

 

Результаты и их обсуждение

Подбор объектов исследования из сырья живот­ного происхождения и продуктов на его основе вы­бран с учетом того, что водорастворимая фракция белков имеет высокую степень инфективности в от­ношении патогенной формы прионного белка. Ана­лиз литературных данных показал, что эффектив­ность выделения и качество очистки ДНК оказывают непосредственное влияние на результаты ПЦР-ана­лиза, так как низкая концентрация ДНК-матрицы и присутствие в пробе ингибиторов реакции являются наиболее частой причиной ложноотрицательных ре­зультатов ПЦР [4]. В связи с этим в наши задачи входили выбор и оценка способов экстракции ДНК и их апробация на различном материале. Для этого было выбрано пять принципиально отличающихся методик выделения ДНК.

1. Лизис с использованием ионного детергента (додецил сульфата натрия) с фенол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом [5].

2. Щелочной лизис с фенол-хлороформовой экс­тракцией и осаждением ДНК этанолом [4].

3. Лизис на основе гуанидинтиоционата с после­дующей нуклеосорбцией на силикагеле с использо­ванием коммерческого набора реагентов SILICA M («Биоком», Москва) [1].

4. Лизис на основе гуанидинтиоционата с после­дующей нуклеосорбцией на магнитном силикагеле с использованием коммерческого набора реагентов Magn S_DNA-uni («Биоком», Москва) [1].

5. Выделение ДНК с помощью ионного детер­гента цетилтриметиламмония бромида с использова­нием коммерческого набора реагентов ПРОБА-ЦТАБ (ДНК-технология, Москва) [4].

Экстракцию ДНК проводили во всех образцах в двадцати повторностях. Количество исследуемых образцов в случае лизиса с использованием ионного детергента (додецил сульфата натрия) с фенол-хло­роформовой экстракцией и осаждением ДНК этано­лом меньше, поскольку он занимет значительное время, до 6 часов.

Оценку эффективности выделения ДНК из проб биологического происхождения и многокомпонент­ных составов на их основе проводили посредством сопоставления результатов ПЦР с участием ДНК, выделенной пятью указанными способами.

Параметрами оценки являлись уровень чувствительности и воспроизводимость результатов ПЦР с использованием того или иного способа экстракции ДНК, а также наличие или отсутствие фоновой ам­плификации, приводящей к появлению шмеров на электрофореграмме. Воспроизводимость ПЦР – это количество положительных результатов исследова­ний из 100. Чувствительность – это количество об­разца в анализируемой пробе. Результаты сравни­тельного анализа ПЦР с участием ДНК, выделенной различными способами, представлены в табл. 1.

 

 

Таблица 1

 

Влияние методик выделения ДНК на эффективность ПЦР

 

Методика экстракции ДНК

Общее

количество

исследований, шт.

Чувствительность, ПЦР

Воспроизводимость результатов ПЦР

Наличие фоновой

амплификации

(шмеры)

С фенол-хлороформовой

экстракцией

66

0,1 %

94

+

Щелочной лизис

140

3 %

53

+

SILICA M

140

0,1 %

100

Magn S_DNA-uni

140

0,1 %

100

ПРОБА-ЦТАБ

140

0,1 %

100

 

 

Исходя из выбранных критериев оценки наиболее эффективными оказались методики, одновременно обеспечивающие удовлетворительную экстракцию ДНК и наиболее полную ее очистку.

Методика щелочной экстракции оказалась мало­пригодной для выделения ДНК из проб животного происхождения, поскольку приходилось увеличивать количество ДНК в пробе для появления продуктов амплификации после проведения электрофореза. При этом также происходило увеличение количества ложноотрицательных проб во всех исследуемых об­разцах. Следствием этого, вероятно, являлись недос­таточная эффективность лизирующего буфера на ос­нове NaOH, а также значительные потери ДНК при переосаждении.

При помощи лизиса на основе гуанидинтиоцио­ната с последующей нуклеосорбцией на силикагеле с использованием коммерческого набора реагентов SILICA M, лизиса на основе гуанидинтиоционата с последующей нуклеосорбцией на магнитном силика­геле с использованием коммерческого набора реа­гентов Magn S_DNA-uni и экстракции ДНК с помо­щью ионного детергента цетилтриметиламмония бромида с использованием коммерческого набора реагентов ПРОБА-ЦТАБ ингибирующего действия разнообразных компонентов, присутствующих в сложносоставных пробах, не зафиксировано.

Применение коммерческих наборов полностью исключило ложноотрицательные результаты в ходе исследования. При использовании коммерческих продуктов время анализа занимало порядка 2 часов.

Поскольку эффективность ПЦР в значительной степени определяется отсутствием в ДНК-пробе ин­гибиторов реакции, нами была проведена работа по определению степени чистоты выделенных ДНК.

Сущность методики определения чистоты ДНК сводится к измерению оптической плотности (D) ДНК при 260 и 280 нм, с последующим расчетом отношения D260/D280. Для чистых препаратов ДНК это соотношение должно соответствовать значению   1,8–2,0. В случае если D260/D280 меньше 1,8, это указывает на недостаточную очистку пробы от белков и других поглотителей УФ; если же D260/D280 больше 2,0, это указывает на присутствие в пробе фенола или хлороформа. Для оценки чувствительности использовали разведения ДНК с концентрацией от 2,4 пг до 2,4*106 пг на 20 мкл реакционной ПЦР-смеси.

Для статистической обработки данных количе­ственные определения содержания ДНК проводили во всех выделенных образцах животного происхо­ждения. Результаты спектрофотометрического анализа препаратов ДНК при 260 нм представлены в табл. 2, при 280 нм – в табл. 3, соотношение D260/D280 в табл. 4.

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2

 

Среднее значение оптической плотности образцов при 260 нм

 

Наименование образца

Значение оптической плотности при 260 нм (D260)

С фенол-

хлороформовой

экстракцией

Щелочной

лизис

SILICA M

Magn

S_DNA-uni

ПРОБА-ЦТАБ

Мозг (усредненная проба серого и белого вещества)

0,231

0,258

0,196

0,191

0,198

Цельная кровь

0,221

0,195

0,192

0,192

0,197

Образцы мяса

0,201

0,191

0,189

0,188

0,195

Колбаса вареная

0,194

0,220

0,192

0,189

0,190

Цельное молоко

0,194

0,221

0,195

0,198

0,193

Сыр

0,195

0,225

0,198

0,197

0,192

Желатин

0,204

0,257

0,198

0,199

0,190

 

 

Из данных, представленных в таблице, видно, что соотношение D260/D280 для препаратов ДНК, полу­ченных с помощью коммерческих реактивов, лежит в пределе 1,8–2,0, что указывает на хорошее качество их очистки. В связи с этим возможное отрицательное влияние ингибиторов ПЦР, содержащихся в образ­цах, можно считать минимальным.

 

Таблица 3

 

Среднее значение оптической плотности образцов при 280 нм

 

Наименование образца

Значение оптической плотности при 280 нм (D280)

С фенол-хлороформовой экстракцией

Щелочной

лизис

SILICA M

Magn S_DNA-uni

ПРОБА-ЦТАБ

Мозг (усредненная проба серого и белого вещества)

0,111

0,121

0,108

0,099

0,108

Цельная кровь

0,106

0,091

0,104

0,099

0,108

Образцы мяса

0,096

0,091

0,103

0,098

0,107

Колбаса вареная

0,095

0,101

0,106

0,096

0,099

Цельное молоко

0,094

0,106

0,107

0,106

0,099

Сыр

0,096

0,107

0,108

0,106

0,101

Желатин

0,100

0,119

0,110

0,109

0,102

 

Таблица 4

 

Отношение оптических плотностей, полученных при 260 и 280 нм

 

Наименование образца

Отношение D260/D280

С фенол-хлороформовой экстракцией

Щелочной

лизис

SILICA M

Magn

S_DNA-uni

ПРОБА-ЦТАБ

Мозг (усредненная проба серого и белого вещества)

2,08

2,13

1,81

1,92

1,83

Цельная кровь

2,09

2,15

1,81

1,94

1,82

Образцы мяса

2,1

2,09

1,83

1,92

1,82

Колбаса вареная

2,05

2,17

1,81

1,96

1,92

Цельное молоко

2,07

2,08

1,82

1,86

1,94

Сыр

2,03

2,1

1,84

1,85

1,91

Желатин

2,04

2,16

1,80

1,82

1,87

 

 

Отношение D260/D280 для образцов ДНК, получен­ных при использовании лизиса с использованием ионного детергента (додецил сульфата натрия) с фе­нол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом и щелочного лизиса с фенол-хлороформо­вой экстракцией и осаждением ДНК этанолом, ко­леблется от 2,03 до 2,10, что свидетельствует о том, что в пробе остались фенол или хлороформ, вслед­ствие чего образцы теряют свою презентативность.

Анализ табл. 2 и 3 показывает, что наибольшее количество животной ДНК из проб биологического происхождения содержится в образцах, полученных лизисом на основе гуанидинтиоционата с после­дующей нуклео­сорбцией на магнитном силикагеле с использованием коммерческого набора реагентов Magn S_DNA-uni («Биоком», Москва). Наибольшее количество животной ДНК из многокомпонентных проб животного происхождения содержится в образ­цах, полученных при выделении ДНК с помощью ионного детергента цетилтриметиламмония бромида с использованием коммерческого набора реагентов ПРОБА-ЦТАБ (ДНК-технология, Москва).

Анализ отношения оптических плотностей D260/D280 для образцов ДНК, полученных при по­мощи лизиса на основе гуанидинтиоционата с после­дующей нуклеосорбцией на силикагеле с использо­ванием коммерческого набора реагентов SILICA M («Биоком», Москва), показывает, что ДНК содер­жится в допустимом пределе от 1,8 до 2,0. Однако все получаемые значения близки к нижней границе. Возможно, что в пробах с ДНК сохранились белко­вые составляющие, хотя они и не снижают качества получаемых образцов.

Таким образом, исследования позволяют сделать вывод, что оптимальным для исследования ДНК жи­вотного происхождения из рассматриваемых мето­дов для анализа биологических проб является лизис на основе гуанидинтиоционата с последующей нук­леосорбцией на магнитном силикагеле с использова­нием коммерческого набора реагентов Magn S_DNA-uni («Биоком», Москва), а для исследования много­компонентных проб – выделение ДНК с помощью ионного детергента цетилтриметиламмония бромида с использованием коммерческого набора реагентов ПРОБА-ЦТАБ (ДНК-технология, Москва).

Выводы

Для того чтобы детально отработать все стадии реализации метода, необходимо проводить иденти­фикацию как патогенной формы прионного белка, так и нормальной. Это позволит оценить потенциальную инфективность различных образцов проб биологического происхождения и многокомпонент­ных составов на их основе.

Для получения более точных результатов нами были экспериментально подобраны условия оценки способов экстракции ДНК и проведена их апробация на различном материале, так как эффек­тивность выделения и качество очистки ДНК оказы­вают непосредственное влияние на результаты ПЦР-анализа. В свою очередь, качество очистки ДНК по­зволит проводить ПЦР-диагностику на содержание патогенной формы прионного белка с высокой точ­ностью.

 

 

References

1. Pokrovskiy, V.I. Priony i prionnye bolezni / V.I. Pokrovskiy, O.I. Kiselev, B.L. Cherkasskiy. – M.: RAMN, 2004. – 384 s.

2. Internet-istochnik http://medicalplanet.su/genetica/201.html

3. Somerville, R.A. Immunodetection of PrPSc in spleens of some scrapie infected sheep but not BSE infected cows / R.A. Somerville, C.R. Birkett, C.F. Farquhar // J. Gen. Virol. – 1997. – Vol. 78. – P. 2389–2396.

4. Internet-istochnik http://www.eurolab.ua/encyclopedia/323/2260/

5. Galkin, A.P. Priony drozhzhey, amiloidozy mlekopitayuschih i problema proteomnyh setey / A.P. Galkin, L.N. Mironova, G.A. Zhuravleva, S.G. Inge-Vechtomov // Genetika. – 2006. – T. 42. – № 11. – S. 1–13.

6. Grigor'ev, V.B. Metody diagnostiki prionnyh zabolevaniy / V.B. Grigor'ev, A.N. Pokidyshev, S.L. Kal'nov, S.M. Klimenko // Voprosy virusologii. – 2009. – № 5. – S. 4–9.

7. Grigor'ev, V.B. Prionnye bolezni cheloveka i zhivotnyh / V.B. Grigor'ev // Voprosy virusologii. – 2004. – T. 6. – S. 4–12.

8. Li, R. Identification of an epitope in the C terminus of normal prion protein whose expression is modulated by binding events in the N terminus / R. Li, T. Liu, B.S. Wong et al. // J. Mol. Biol. – 2000. – Vol. 301. – P. 567–574.

9. Apetri, A.C. Early Intermediate in Human Prion Protein Folding As Evidenced by Ultrarapid Mixing Experiments / A.C. Apetri, K. Maki, H. Roder, W.K. Surewicz // J. Am. Chem. Soc. – 2006. – Vol. 128. – P. 11673–11678.