EXPERIENCE OF THE DEPARTMENT OF «BIONANOTECHNOLOGY» OF THE KEMEROVO INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY IN THE FIELD OF BIOTECHNOLOGY OF OBTAINING RECOMBINANT ENZYME PREPARATIONS
Abstract and keywords
Abstract (English):
The review of modern methods of obtaining recombinant enzymes for food industry is given. Optimum condi-tions to obtain recombinant L-phenylalanine-ammonia-lyase Rhodosporidium toruloides allocated from Escherichia coli have been established. The share of the special-purpose protein obtained after the induction was 40 % of the total cell protein. The clearing of the obtained protein on Ni-NTA agarose has been done. The degree of protein clearing was more than 90 %.

Keywords:
Recombinant strain, enzyme, cloning, genetic engineering, construction, L-phenylalanine-ammonia-lyase, trans-formation, expression vector.
Text
Publication text (PDF): Read Download

 

Введение

Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы, способные ускорять химические реакции, протекающие в животном и растительном мире. Достижения современной технологии получе­ния ферментных препаратов значительно расширили возможности применения ферментов в первую оче­редь в медицине и пищевой промышленности. На сегодняшний день мировой рынок ферментов доста­точно стабилен. Главными игроками на нем оста­ются такие компании, как Novozymes, Danisco, Genzyme, Roche, Allergen, DSM и BASF. Компания Novozymes контролирует 46 % рынка ферментных препаратов. Остальная часть (36 %) поделена между Danisco, Genzyme, Roche, Allergen, DSM и BASF [1].

В последнее десятилетие сохраняют актуальность исследования по применению ферментов для целей промышленности, тонкого органического синтеза, защиты окружающей среды, медицинской и эколо­гической диагностики, пищевой промышленности. По данным ряда аналитических служб, европейский рынок пищевых ферментов постоянно расширяется и наращивает свои объемы, прибавляя ежегодно 8 %, к 2011 году он достиг объема в 846,2 млн евро в де­нежном выражении [1]. Одно из наиболее успешно развивающихся направлений – ферменты для вы­печки. По данным Frost and Sullivan, этот сегмент, занимающий около трети всего рынка пищевых ферментов, за последние пять лет вырос почти на 40 %. К 2010 году объем рынка составил более         53 млн евро [1].

Основная доля в структуре ферментов для пище­вой промышленности приходится на гидролазы. Так, на долю α- и β-амилаз приходится 15 % объема рынка ферментов для пищевой промышленности, на долю глюкоамилазы – 6 %. Амилаза является основ­ным ферментом, применяемым в различных секторах пищевой промышленности: как в производстве пива, так и в хлебопечении. Вторым по значимости фер­ментом является протеаза, на долю которой прихо­дится 14 % от объема рынка. Заметная доля (10 %) приходится на препараты на основе ксиланазы, кото­рые используются преимущественно при производ­стве спирта и алкогольных напитков. Все большую востребованность в пищевой промышленности при­обретают полиферментные композиции – препараты на основе двух и более ферментов, в большинстве случаев из класса гидролаз. В настоящий момент на их долю приходится почти 35 % объема рынка фер­ментов для пищевой промышленности [2].

Промышленное производство ферментов для пи­щевой промышленности восходит к 1874 году, когда датский ученый Христиан Хансен получил реннин (химозин) из желудков телят для использования в производстве сыров. В настоящее время химозин по­лучают с использованием микроорганизмов. Для по­лучения ферментных препаратов пищевого назначе­ния используют органы и ткани сельскохозяйствен­ных животных, культурные растения (ананас, соя, папайя, инжир) и специальные штаммы микроорга­низмов. В настоящее время наибольшее применение нашли ферменты микробного происхождения (ре­комбинантные ферменты). Кроме того, при получе­нии ферментов широко используют инновации, ко­торые построены на таких направлениях, как моди­фикация свойств индустриальных ферментов с це­лью повышения их активности и удешевления целе­вых продуктов; скрининг новых микроорганизмов – продуцентов ферментов; получение новых рекомби­нантных ферментов с заданными свойствами; разра­ботка пищевых нанотехнологий с использованием ферментов.

 

 

_______________________

*Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы, государственный контракт № 16.740.11.0239.

 

 

Использование технологий рекомбинантной ДНК сделало возможным производство новых ферментов, используемых в процессах пищевых производств. Такие ферменты можно обнаружить путем скри­нинга микроорганизмов в различных средах с ис­пользованием современных методов белковой инже­нерии и молекулярной эволюции [4]. В результате получены некоторые важные для пищевой промыш­ленности ферменты, такие как амилазы и липазы. Другим важным достижением является оптимизация условий производства штаммов микроорганизмов. Например, недавно разработаны некоторые штаммы микроорганизмов, позволяющие увеличить выход ферментов за счет удаления нативных генов, коди­рующих внеклеточные протеазы. Кроме того, неко­торые штаммы микроорганизмов были модифициро­ваны с целью снижения образования токсичных ме­таболитов [4, 5].

Усложнение процессов пищевого производства увеличивает спрос на широкий спектр ферментов с характеристиками, совместимыми с условиями обра­ботки продуктов питания [6]. Например, широко ис­пользуемые заменители сахара, такие как глюкозный или фруктозный сиропы, как правило, производятся из кукурузного крахмала с использованием гидроли­тических ферментов. На первом этапе гидролиза крахмала он нагревается с α-амилазой до 105 °С в течение 2–5 мин, затем 1–2 ч выдерживается при температуре 90–100 °C. С появлением ДНК-техноло­гий стало возможным конструирование амилаз с по­вышенной термоустойчивостью и улучшенной со­вместимостью с другими параметрами процесса сжижения. Эти свойства стали возможны благодаря изменениям в аминокислотной последовательности α-амилазы через модификации в ДНК генов фер­мента. С использованием ДНК-технологий также были улучшены свойства других ферментов, исполь­зуемых в пищевой промышленности [6].

 

Литературный анализ

Промышленному производству рекомбинантных ферментов предшествуют интенсивные исследова­ния, которые завершаются конструированием фер­ментов [10]. Этот процесс обычно включает сле­дующие стадии:

1) выбор штамма-хозяина;

2) конструирование вектора экспрессии;

3) трансформация штамма-хозяина;

4) обнаружение оптимального рекомбинантного штамма;

5) дополнительные исследования и характери­стика штамма-продуцента.

Каждая из этих стадий управляется рядом обстоя­тельств, связанных с идентификацией и свойствами организма-хозяина и доступностью генетических ме­тодов для модификации и трансформации [10].

 

1. Выбор штамма-хозяина

 

Большинство штаммов, используемых в настоя­щее время в пищевой промышленности, были выде­лены из относительно небольшого числа бактери­альных и грибковых видов: Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Aspergillus niger или Aspergillus oryzae. Эти микроорганизмы имеют долгую историю ис­пользования в качестве надежных источников на­тивных ферментов, а также доказанный эффектив­ный рост в промышленных условиях. Кроме того, они поддаются генетическим манипуляциям и из­вестны своей способностью продуцировать большое количество ферментов в ферментативную среду. Эти характеристики делают их удобными для использо­вания в качестве штаммов для производства боль­шого количества ферментов [11]. Некоторые микро­организмы, такие как Escherichia coli K-12, Fusarium venenatum и Pseudomonas xuorescens, успешно ис­пользуются для экспрессии ферментов, используе­мых в пищевой промышленности [11].

Хотя большинство микроорганизмов, используе­мых в настоящее время, выделяют фермент в фер­ментативную среду, грамотрицательные бактерии   E. coli K-12 (источник химозина) и P. xuorescens Biovar I (источник α-амилазы) скорее накапливают, чем секретируют ферменты. Выделение и очистка синте­зированных ферментов обычно включают больше стадий, чем очистка [11]. Штаммы некоторых мик­роорганизмов образуют множество внеклеточных ферментов. Такие ферменты могут быть включены в состав ферментных препаратов и стимулировать не­желательные процессы в продуктах питания.

Bacillus subtilis и ее производные. Некоторые ферменты, используемые в пищевой промышленно­сти, были недавно получены из рекомбинантных штаммов грамположительных бактерий B. subtilis и B. licheniformis. B. subtilis использовалась в качестве источника таких промышленно важных ферментов, как α-амилазы и протеазы. Особую важность имеет штамм B. subtilis 168, геном которого недавно был секвенирован [12]. Безопасность рекомбинантных ферментов, полученных из B. subtilis 168, подтвер­ждена документально.

Другие виды Bacillus, в том числе B. licheniformis, B. amyloliquefaciens и B. stearothermophilus, приме­няют в качестве источников других ферментов, в ос­новном амилаз. В последнее десятилетие B. licheni-formis и B. amyloliquefaciens успешно применили для экспрессии рекомбинантных энзимов. Определили полные геномные последовательности двух промышленных штаммов B. licheniformis и обнаружили гомологию с B. subtilis, но отличие от последовательностей B. cereus и B. anthracis, являющихся патогенами для человека; B. cereus образует ряд токсинов, поэтому является ядовитым для пищевой продукции [13].

Безопасность B. amyloliqueafaciens, B. licheni-formis и B. subtilis обсуждалась в некоторых обзорах [14]. Pedersen оценил цитотоксичность неко­торых промышленных штаммов этих видов [13]. Ис­следуемые штаммы не взаимодействовали с антите­лами против энтеротоксинов B. cereus.

Безопасность B. subtilis и B. licheniformis оцени­валась Агентством защиты окружающей среды США. B. subtilis и подобные виды также использо­вали для производства ферментов и фармацевтиче­ских препаратов, антибиотиков, пуриновых основа­ний и других соединений, имеющих пищевое, меди­цинское и промышленное применение [13].

Одним из преимуществ использования видов Bacillus для масштабного производства ферментов является их способность секретировать ферменты непосредственно в ферментативную среду. Однако производство некоторых нативных внеклеточных протеаз представляет определенные трудности с ис­пользованием видов Bacillus. Чтобы избежать фер­ментативной деградации внеклеточными протеазами и увеличить выход фермента, производители фер­ментов используют мутантные штаммы микроорга­низмов [13].

Escherichia coli K-12. В 1990 году сообщалось о ферментном препарате химозине, выделенном из     E. coli K-12 (21 CFR 184.1685; Flamm). Химозин – это молокосвертывающий фермент, также известный под названием реннин. Штаммы для производства химозина содержат ген бычьего прохимозина. Про­химозин накапливается в клетках E. coli K-12 в форме включенных тел. Клетки затем лизируются, и включенные тела выделяются и растворяются. Про­химозин, присутствующий в растворе, очищается и переводится в химозин кислотной обработкой [15].

Безопасность препаратов химозина в первую оче­редь основана на опубликованных доказательствах того, что E. coli K-12 использовалась в качестве ла­бораторного организма более 30 лет без случаев за­ражения и поэтому не образует токсинов. E. coli     K-12 – это одна из наиболее интенсивно изучаемых бактерий. Ее геном был секвенирован в 1997 году.   E. coli K-12 имеет историю безопасного использования в производстве специальных химических веществ и лекарственных препаратов [15].

Pseudomonas fluorescens. Рекомбинантные штаммы позволяют получать термостабильную       α-амилазу. Pseudomonas fluorescens – это грамотрицательная почвенная бактерия, не вызывающая заболеваний человека. Она повсеместно распространена в окружающей среде и, вероятно, накапливается в сырых овощах и фруктах. Геном P. fluorescens (штамм Pf-5) был секвенирован в 2005 году [5].

Aspergillus oryzae и Aspergillus niger находят широкое применение в производстве ферментов для пищевой промышленности. A. oryzae применяют в производстве ферментированных продуктов, в том числе соевых соусов, рисового вина и т.д. A. niger широко используется для производства лимонной кислоты [9]. A. oryzae и A. niger традиционно рас­сматриваются как нетоксичные и непатогенные, в то время как известно, что оба вида способны к образо­ванию малых количеств токсичных вторичных мета­болитов, например, микотоксинов [12].

Технологии трансформаций A. oryzae и A. niger с использованием ДНК-технологий получили свое развитие в 1980-е годы. Впоследствии оба микроор­ганизма успешно использовались для экспрессии ферментов. Успех промышленного использования    A. oryzae и A. niger был вызван новыми исследованиями их способности к образованию микотоксинов [9]. Известно, что определенные штаммы A. oryzae и      A. niger, используемые для продуцирования ферментов, способны к образованию микотоксинов или других вторичных метаболитов с разной степенью токсич­ности. Образование этих веществ обычно происхо­дит при стрессовых условиях и не всегда подверга­ется контролю при ферментативных процессах. В литературе описаны результаты предварительных исследований, которые можно свести к следующему [12]:

– если возможно, при выборе штаммов исполь­зуются нетоксичные и непатогенные виды;

– заново выделенные и неохарактеризованные штаммы должны проходить обязательные испытания на способность к образованию токсинов перед ис­пользованием;

– если штамм способен к образованию микоток­синов, необходимо осуществлять контроль­ные меры, чтобы гарантировать допустимый уровень ферментного препарата по токсикологическим пока­зателям.

 

2. Конструирование рекомбинантных штаммов

 

Гены, кодирующие рекомбинантные ферменты, обычно вводятся в организм-хозяин с использова­нием векторов экспрессии. Вектор экспрессии – это плазмида ДНК, которая несет кассету экспрессии. Существенными компонентами экспрессии являются промотор, ген, кодирующий желаемый фермент, и терминатор. Промотор и терминатор – это регуля­торные последовательности, кодирующие транс­крипцию гена, кодирующего фермент. Векторы экс­прессии содержат также ДНК, выделенные из бакте­риальных плазмид. Для конструирования специфи­ческих векторов экспрессии обычно используют охарактеризованные, доступные в продаже плазмиды [16].

Плазмида pUB110 была первоначально выделена из Staphylococcus aureus [17] и впоследствии секве­нирована [18]. Плазмида реплицируется в B. subtilis и используется при конструировании векторов экс­прессии для производства ферментов в B. subtilis и других видах B. subtilis. Плазмида несет ген kanr (ус­тойчивый к канамицину и неомицину), также из­вестный как ген neo или nptII, или ph1. Плазмида также несет два других гена, один из которых коди­рует основной инициирующий белок репликации, который инициирует копирование плазмиды, а дру­гой кодирует белок подвижности, который отвечает за подвижность плазмиды от одного штамма Bacillus к другому [19].

Ген подвижности обычно удаляют при конструи­ровании вектора экспрессии во избежание неста­бильности вектора. Гены kanr и ph1 обычно явля­ются избирательными маркерами при конструирова­нии векторов трансформации. Однако они не всегда приводят к образованию окончательных векторов экспрессии. Большинство векторов экспрессии со­держат либо ген kanr, либо ph1, однако некоторые векторы экспрессии не содержат ни одного из них [6].

Известны и другие бактериальные плазмиды, ко­торые используются при конструировании векторов экспрессии для получения рекомбинантных фермен­тов [6]. В некоторых случаях комбинируются фраг­менты, полученные из двух или более плазмид. Большинство векторов экспрессии несут собствен­ные гены селективных маркеров. Однако в ряде слу­чаев конструируют два различных вектора, один из которых несет экспрессию, а другой – ген селектив­ного маркера. В каждом случае штамм-хозяин под­вергается трансформации с обоими векторами [6].

Представляющая интерес плазмидная система была разработана для индуцированного производ­ства термостабильной α-амилазы в грамотрицатель­ной бактерии Pseudomonas xuorescens [21]. Вектор экспрессии несет ген α-амилазы при контроле инду­цированного tac-промотора. Вспомогательная плаз­мида несет ген lacI из E. coli. Ген lacI кодирует бе­лок-репрессор, который связывается с tac-промото­ром и ингибирует экспрессию α-амилазы. Только по­сле индуцированного роста клеток достигается про­дуцирование α-амилазы, вызванное добавлением в ферментационную среду аналога лактозы изопропил-тио-β-В-галактопиранозида, предотвращающего свя­зывание репрессора LacI с tac-промотором [21].

Бактериальные векторы экспрессии могут быть сконструированы для введения в хромосомы хозяина или для экстрахромосомной (автономной) реплика­ции. Векторы экспрессии, используемые для произ­водства ферментов в бактериях или грибах, обычно конструируют для введения в геном хозяина. Чаще полный вектор экспрессии вводится в грибковый ге­ном. В альтернативном подходе вектор экспрессии вырезается рестрикционным ферментом и фрагмент вектора, содержащий кассету экспрессии и ген се­лективного маркера, вводится в организм хозяина [6].

Недавно была разработана технология введения вектора ДНК в мультиплетный локус в геноме хо­зяина. В зависимости от специфической комбинации хозяина/вектора вектор ДНК, который несет либо кассету экспрессии и ген селективного маркера, либо только кассету экспрессии, используют для транс­формации. Сила промотора является определяющей для достижения эффективной экспрессии рассматри­ваемого фермента. Примеры сильных промоторов, используемых в видах Bacillus, включают промоторы amyL (B. licheniformis α-амилазы) и amyM                (B. stearothermophilus амилазы) [6].

Выбор технологии, используемой для перевода вектора ДНК в клетки хозяина, зависит от свойств хозяина и природы вектора экспрессии. При произ­водстве ферментов бактериальные клетки трансфор­мируют вектором ДНК с использованием конъюга­ции, электропорирования или векторной инкубации с протопластами, т.е. клетками, стенки которых были химически удалены. Дрожжи и грибы обычно транс­формируют инкубированием ДНК с протопластами.

Большинство векторов экспрессии, используемых в производстве ферментов, содержат один или более генов, которые позволяют проводить селекцию трансформированных генов. Селекция бактериаль­ных трансформантов обычно проводится либо с ис­пользованием генов селективных маркеров, устойчи­вых к антибиотикам, либо путем дополнения хромо­сомных ауксотрофных мутаций функциональным геном, несущим вектор экспрессии. В некоторых примерах маркеры, устойчивые к антибиотикам, удаляют на финальных стадиях бактериальной экс­прессии. В таких случаях селекция проводится путем скрининга микробиологических колоний по фермен­тативной активности [19].

Большинство векторов экспрессии, используемых для производства ферментов, содержат ген kanr, ко­дирующий фермент аминогликозид 3-фосфотранс­феразу II, известный как APH(3_)II или NPTII. APH(3_)II катализирует фосфорилирование канами­цина или неомицина и в то же время инактивирует эти антибиотики. APH(3_)II также часто использу­ется как селективный маркер при разработке расте­ний методом генной инженерии [19].

Другие селективные маркеры, используемые в производстве ферментов, включают гены ampr и tet. Ген ampr применяли для селекции трансформантов при конструировании штамма E. coli K-12 для полу­чения химозина. Ген ampr кодирует β-лактамазу, ко­торая катализирует гидролиз антибиотиков пеницил­линового ряда, в том числе ампициллин. Гены tet и kanr использовались в качестве селективных марке­ров при конструировании штамма P. xuorescens для производства термостабильной α-амилазы. Ген tet отвечает за устойчивость к тетрациклину и кодирует белок, связанный с мембраной, который вытесняет тетрациклин из микробной клетки.

 

3. Источники рекомбинантных ферментов

 

Рекомбинантные ферменты можно выделить из множества источников, в том числе микроорганиз­мов, растений и тканей животного происхождения. Они обычно идентифицируются с хорошо извест­ными ферментами с длинной историей использова­ния в пищевой промышленности. Например, химо­зин, выделенный из рекомбинантных штаммов         E. coli K-12, Kluyveromyces marxianus var. lactis и      A. niger var. awamori [17].

Большинство рекомбинантных ферментов, ис­пользуемых в настоящее время в пищевой промыш­ленности, выделены из культивируемых микроорга­низмов с известными характеристиками. Однако раз­работка современных высокоэффективных техноло­гий скрининга облегчает открытие новых ферментов из микроорганизмов окружающей среды. В этой связи ДНК выделяют непосредственно из объектов окружающей среды и используют для создания биб­лиотек экспрессии в E. coli или других подходящих видах. Библиотеки экспрессии затем подвергают скринингу, чтобы идентифицировать ферменты с нужными характеристиками. Современные ПЦР-технологии используют для ограничения ДНК, пред­назначенной для введения в организм хозяина с по­следовательностью, кодирующей желаемый фермент [17].

Термофильные ферменты с оптимизированными свойствами имеют большое значение в процессах хлебопечения и крахмалперерабатывающей про­мышленности. Некоторые гены, кодирующие такие ферменты, как термостабильные α-амилазы и ксила­назы, были выделены из термофильных микроорга­низмов. Свойства ферментов также могут быть адап­тированы к специфическим условиям с использова­нием современных генетических манипуляций. Сайт-специфичный мутагенез можно использовать для специфических изменений аминокислотной последо­вательности фермента. Сайт-специфичный мутагенез наиболее эффективен, когда известна трехмерная структура фермента и обоснованы взаимосвязи ме­жду структурой и свойствами фермента [17].

В последние годы был разработан подход для улучшения свойств фермента, известный как моле­кулярная эволюция. Процесс молекулярной эволю­ции включает несколько этапов. В первую очередь выбираются один или несколько «родительских» ге­нов. Если выбрано несколько генов, они обычно вы­деляются из различных источников для обеспечения разнообразия последовательностей. Эти гены впо­следствии подвергают мутациям случайным образом с использованием таких методов, как ПЦР-мутаге­нез, случайный мутагенез или генная перестановка. Библиотека измененных генов затем трансформиру­ется в подходящий организм-хозяин. Клоны подвер­гают скринингу с использованием высокоэффектив­ных методов идентификации ферментов. Гены, ко­дирующие эти ферменты, выделяют, секвенируют и обычно повторяют процесс до тех пор, пока не полу­чится фермент с желаемыми характеристиками [17].

Рекомбинантные штаммы затем можно улучшить с использованием классического мутагенеза. Гриб­ковые векторы экспрессии можно внедрить в геном хозяина в различные локусы и разном количестве копий. Следовательно, трансформация приводит к популяции трансформантов, образующих различные уровни необходимых ферментов. Эти трансфор­манты впоследствии растут при различных условиях, оцениваются на предмет ферментативной экспрессии и других характеристик. Как только произведенный трансформант идентифицируется, он должен подвер­гаться мутагенезу с использованием химических му­тагенов или ультрафиолетового и радиационного из­лучения. Впоследствии популяцию подвергают скринингу, чтобы получить фермент с желаемыми свойствами.

 

4. Ферментация

 

Микробиологические ферменты, нативные или рекомбинантные, производятся путем контролируе­мой ферментации продуцируемых штаммов. В большинстве случаев ферментация проводится как непрерывный процесс в крупных аэрированных ферментерах при строго контролируемых парамет­рах, таких как температура, рН и аэрация. Культура периодически тестируется, чтобы гарантировать от­сутствие микробиологических составляющих. Фер­ментативная среда содержит нутриенты и соедине­ния, ускоряющие ферментативный процесс. Как пра­вило, среда содержит декстрозу, ликер кукурузного экстракта, крахмал, соевые бобы, дрожжевой экс­тракт, аммоний, мочевину и минералы, такие как фосфаты, хлориды или карбонаты. Другие компо­ненты могут включать пеногасители, кислоты или щелочи для поддержания рН. Для оптимального производства среда должна удовлетворять питатель­ным требованиям продуцированного штамма [6].

Большинство рекомбинантных ферментов, произ­водимых на сегодняшний день, выделяются в фер­ментативную среду. После окончания ферментации ферментативный бульон отделяется от клеточного дебриса с использованием флокуляции или фильтра­ции. Затем фермент концентрируют с помощью ультрафильтрации и испарения. Фермент, накоплен­ный внутри клетки, отделяется от клеточной массы, растворяется и концентрируется. Концентрирован­ный фермент затем стерилизуется с использованием микробной фильтрации и соединяется с такими со­единениями, как сахароза, мальтоза, мальтодекстрин, сорбат калия, бензоат натрия. Для многих примене­ний в пищевой промышленности ферменты можно также гранулировать, таблетировать или иммобили­зовать на нерастворимых носителях [6].

 

5. Очистка ферментного препарата

 

Ферменты используются в пищевой промышлен­ности в очень малых концентрациях. Количество ферментного препарата, используемого в пищевой промышленности, обычно рассчитывается на осно­вании полных твердых органических частиц. Твер­дые органические частицы включают как сам фер­мент, так и другие органические компоненты, кото­рые получаются при продуцировании микроорга­низма и ферментативном процессе. Ферментный препарат тестируется в соответствии с известной процедурой. Тестируемым материалом обычно явля­ется концентрированный фермент [6].

Таким образом, производство ферментных пре­паратов, выделенных из природных источников, вос­ходит к концу XIX века. Развитие молекулярной ге­нетики и клеточной биологии в последние четыре десятилетия изменило производство ферментов. Это стало возможным благодаря клонированию генов, кодирующих ферменты, и введению их в микроорга­низм-хозяин, что хорошо приспособлено к крупно­масштабной промышленной ферментации. Выход фермента может быть существенно увеличен благо­даря использованию эффективных промоторов и введению мультиплетных копий в фермент-коди­рующий ген. Кроме того, стало возможным адапти­ровать свойства ферментов к условиям пищевых производств, таким как температура и рН. Это было достигнуто путем изменения аминокислотной после­довательности ферментов с использованием либо рациональной конструкции, либо молекулярной эво­люции.

 

Безопасность рекомбинантных

ферментных препа­ратов

 

Ферменты, используемые в пищевой промыш­ленности, продаются в качестве коммерческих фер­ментных препаратов (табл. 1). Ферментный препа­рат, как правило, содержит основной фермент и не­сколько дополнительных веществ, таких как раство­рители, консерванты и стабилизаторы [3]. Фермент­ные препараты могут также содержать другие фер­менты и метаболиты из организма-продуцента. Все эти материалы имеют соответствующую степень чистоты [3]. Безопасность ферментов для пищевой промышленности, выделенных из рекомбинантных микроорганизмов, интенсивно обсуждалась в лите­ратуре и утверждена в руководящих документах, вы­данных контролирующими органами и международ­ными организациями, например ScientiWc Committee for Food [7]. Ключевым компонентом в оценке безо­пасности фермента является патогенный и токсиче­ский потенциал штамма микроорганизмов [8]. Хотя ни патогенные, ни токсические микроорганизмы не используются в производстве ферментов для пище­вой промышленности, они способны к образованию токсичных вторичных метаболитов в условиях фер­ментации. Некоторые из этих микроорганизмов в на­стоящее время используются в качестве источников рекомбинантных ферментов [9].

 

Таблица 1

 

Ферменты из рекомбинантных микроорганизмов

 

Микроорганизм-

ис­точник

Фермент

A. niger

Фитаза, химозин, липаза

A. oryzae

Эстераза-липаза, аспартановая протеаза, глюкозооксидаза,

лак­каза

B. licheniformis

Пектиновая эстераза, фософо­липаза А1, α-амилаза

B. subtilis

Пуллуланаза, α-ацетолактат,

де­карбоксилаза, α-амилаза

E. coli K-12

Химозин

F. venenatum

Ксиланаза

K. marxianus

var. lactis

Химозин

P. xuorescens

α-амилаза

Trichoderma reesei

Пектиновая липаза

 

Безопасность производства ферментативных штаммов остается в центре внимания. Концепция развития безопасных штаммов с использованием хо­рошо изученных непатогенных, нетоксичных штам­мов, особенно имеющих историю использования в пищевых производствах, получила свое развитие в пищевой промышленности [22].

Имеющиеся способы улучшения штаммов уже внесли вклад в создание более эффективных и безо­пасных способов продуцирования ферментов. Эта тенденция будет, несомненно, продолжаться, так же как и знания о генетических подходах микроорга­низмов, используемых для продуцирования микро­организмов и новых генетических подходов.

Федеральное государственное бюджетное обра­зовательное учреждение высшего профессиональ­ного образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности» на протяжении последних нескольких лет занимается разработками в области технологий получения рекомбинантных ферментных препаратов. Основные направления ис­следования отражены в табл. 2.

Таблица 2

 

Разработки Кемеровского технологического института пищевой промышленности в области технологий

получе­ния рекомбинантных ферментов

 

Ферментный препарат

Клас­сифи­кация фер­мента

Рекомби­нантный

штамм-проду­цент

Применение

L-фенилала­нин-аммо­ний-лиаза (PAL)

КФ 4.3.1.5

E. coli

Биотрансформация фенилаланина в технологии про­дуктов питания для больных фе­нилкетонурией

Кератиназа

КФ 3.4.99.12

B. subtilis

Гидролиз кератин­содержащего сырья

Липаза

КФ 3.1.1.3

Candida

antarctica

Гидролиз липидов

Пепсин

КФ 3.4.23.12

Erwinia curitovora

Коагуляция белков молока

Химотрип­син

КФ 3.4.21.1

E. coli

Гидролиз белков молока

 

В настоящей статье отражены результаты выбора методов получения рекомбинантной L-фенилаланин-аммоний-лизы Rhodosporidium toruloides, выделен­ной из E. coli. L-фенилаланин-аммоний-лиаза явля­ется весьма востребованным в промышленности ферментом, однако штамм E. coli обладает рядом технологических неудобств, связанных с невысокой каталитической активностью и достаточной термо­стабильностью. Поэтому для получения пригодного для использования в промышленности фермента не­обходимы исследования, направленные на оптими­зацию технологии получения данного фермента. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что рекомбинантная L-фенилаланин-аммоний-лиаза соответствует требованиям руководящих докумен­тов, утвержденных международной организацией ScientiWc Committee for Food.

 

Объекты и методы исследований

Синтез гена осуществлялся по методике [23] на автоматическом секвенаторе ABI3730xl согласно последовательности гена pal, выделенного из               R. toruloides. Синтез осуществляли таким образом, чтобы он на своих концах содержал сайты рестрик­ции NcoI и HindIII и был предназначен для амплифи­кации и последующей встройки области гена в поли­линкер pET28a.

Амплификацию гена pal проводили методом по­лимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработку оли­гонуклеотидных праймеров для амплификации гена проводили с помощью программы OLIGO (версия 3.3) с учетом данных о первичной структуре гена pal. В качестве матрицы для амплификации кодирующей области гена pal из R. toruloides использовали после­довательность данного гена из баз данных GenBank (X12702.1). Праймеры содержали на          5’-концах до­полнительные последовательности, включающие сайты рестрикции NcoI для прямого праймера и HindIII для обратного, и были предназначены для амплификации и последующей встройки структур­ной области гена в полилинкер экспрессирующего вектора pET28a по соответствующим сайтам. Обрат­ный праймер был сконструирован таким образом, чтобы полученный ампликон не содержал стоп-ко­дона и обеспечивалась состыковка рамок считыва­ния гена и последовательности His6.

ПЦР проводили в 20–50 мкл раствора, приготов­ленного на основе десятикратного буфера для Taq-полимеразы, который содержал 200 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0,5 мкМ праймеров,   2 мМ MgSO4, 10 нг матрицы, 2 единицы Taq ДНК-полимеразы и 0,1 единицы Pfu ДНК-полимеразы. Температуру отжига олигонуклеотидов рассчиты­вали по   эмпирической   формуле   Tm = 67,5 + 34[%GC]  –

– 395/n, где %GC = (G + C)/n, n – число нуклеотидов. Анализ продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1%-ном агарозном геле.

Секвенирование проводилось по методу Сэнгера согласно протоколу производителя автоматического секвенатора ABI3730xl фирмы Applied Biosystems (USA) с использованием наборов для секвенирова­ния BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.

Гидролиз ДНК рестриктазами Ncol и HindIII проводили в буферных растворах при оптимальных условиях инкубационной среды, рекомендуемых для каждого из ферментов фирмами-производителями. Полноту гидролиза контролировали электрофорезом в агарозном геле. Реакционную смесь очищали от продуктов реакции с помощью набора QuickClean.

Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля. Образцы ДНК разделяли методом электрофореза в трис-ацетатном буфере в блоке 0,7–0,8%-го агароз­ного геля (Bio-Rad, США), содержащего 0,3 мкг/мл этидиум бромида, и анализировали по флуоресцен­ции в ультрафиолете при длине волны 254 нм. Уча­стки геля, содержащие интересующие фрагменты, вырезали и переносили в микроцентрифужные про­бирки, после чего проводили элюцию фрагментов ДНК с помощью набора «Выделение ДНК из агароз­ных гелей» фирмы Boeringer Mannheim (Германия). В пробирку добавляли раствор перхлората натрия из расчета 400 мкл на 100 мг веса вырезанного геля. Полученную смесь нагревали до 65 °С, при этом ага­роза растворялась в солевом буфере. В суспензию вносили стеклянные микрошарики (Glass milk) из расчета 20 мкл на 100 мг веса геля. В солевом рас­творе ДНК, содержавшаяся в геле, адсорбировалась на поверхности этих шариков. Далее шарики промы­вали (последовательное осаждение – ресуспендиро­вание) один раз тем же солевым раствором и два раза       70%-ным этанолом. Десорбировали ДНК с шари­ков путем ресуспендирования в буфере ТЕ (10 мМ Трис-НС1-буфер, рН 7,4; 1 мМ ЭДТА) из расчета 50 мкл на 100 мг веса геля.

Лигирование. Выделенные по описанной выше методике продукты гидролиза рестриктазами век­торной ДНК и ампликона гена pal лигировали ДНК-лигазой фага Т4. Концентрации вектора и гена в ре­акционной смеси были равными 5 нг/мкл. Концен­трация ДНК-лигазы фага Т4 в реакционной смеси составляла 5 ед/мкл. Рекцию проводили при 15 °С в течение 24 ч.

Приготовление компетентных клеток E. coli и трансформация. Проводили при помощи стандарт­ных методик [24]. Компетентные клетки BL21(DE3)/pLysECodonPlus RP и Rozetta(DE3) трансформировали плазмидой pETPAL-28a и высе­вали на чашки с агаризованной средой LB, содержа­щей 40 мкг/мл канамицина и 20 мкг/мл хлорамфени­кола. В контрольном варианте клетки трансформи­ровали плазмидой pET-28a. Чашки инкубировали при 37 °С в течение ночи, после чего высевали трансформанты в 10 мл LB, содержащих 40 мкг/мл канамицина и 20 мкг/мл хлорамфеникола. Культуры инкубировали на роторной качалке при 180 об/мин и 23 °С до достижения оптической плотности 0,7 при   λ = 590, затем индуцировали экспрессию добавлением ИПТГ до 1 мМ и инкубировали клетки на роторной качалке при тех же условиях в течение 24 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4 °С в те­чение 15 мин при 5000 × g. Биомассу ресуспендиро­вали на льду в 0,5 мл буфера для лизиса (50 мМ на­трий-фосфатный буфер, рН 7,0, 5 мМ 2-мерка-птоэта­нол, 0,1 мМ ФМСФ). Клетки разрушали при помощи ультразвукового дезинтегратора (4 импульса по 15 с с перерывом для охлаждения в 1 мин). Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 13000 × g, 15 мин и 4 ºС.

Электрофорез в ПААГ. Электрофорез клеточных лизатов и белков проводили с использованием диск-электрофореза в 10 % полиакриламидном геле     (ПААГ) в денатурирующих редуцирующих условиях по Леммли.

Очистка PAL хроматографией на Ni-NTA носи­теле. Очистку L-фенилаланин-аммоний-лиазы, сли­той на С-конце с олигопептидом из шести остатков гистидина (PAL-His), проводили при помощи набора Ni-NTA Spin Kit фирмы Qiagen.

Все этапы очистки проводили при 4 °C. По 400 мкл осветленных лизатов клеток BL21(DE3) pLysE CodonPlus RP/pETPAL-28a и Rozetta (DE3)/pETPAL-28a наносили на колонки с сорбентом Ni-NTA Silica, предварительно уравновешенным буфером NPI-10, и центрифугировали 5 мин при 270 × g. На дальней­ших этапах центрифугирование проводили при 890 × g в течение 2 мин. Колонки промывали дважды 600 мкл буфера NPI-20. Затем целевой белок элюировали  400 мкл буфера NPI-500. Поскольку L-фенил-аланин-аммоний-лиаза Rhodosporidium toruloides является тетрамерным белком и, как следствие, могла быть прочно связана с сорбентом, на заключительном этапе провели элюцию 300 мкл буфера NP (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl), содержащего 100 мМ ЭДТА.

 

Результаты и их обсуждение

В связи со сложностью геномной организации гена pal (6 интронов) он был синтезирован согласно последовательности гена pal, выделенного из             R. toruloides (GenBank: X12702.1). Ген обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NcoI и HindIII для полу­чения липких концов.

Для клонирования выбран экспрессионный век­тор pET28а, предназначенный для экспрессии ре­комбинантных белков в E. coli и содержащий в своем составе ген резистентности к канамицину. Кроме того, вблизи полилинкера вектор содержит последо­вательность, кодирующую His-Tag конец, что значи­тельно облегчает проведение хроматографии на Ni-содержищем носителе. При подготовке к клонирова­нию вектор обрабатывали эндонуклеазами рестрик­ции NcoI и HindIII и очищали от продуктов реакции с помощью набора QuickClean. После гидролиза эн­донуклеазами рестрикции у вектора появились лип­кие концы, комплиментарные концам гена pal.

В условиях индукции в клетках E. coli BL21(DE3)/pLysECodonPlus RP и Rozetta(DE3), трансформированных плазмидой pETPAL-28a с ге­ном L-фенилаланин-аммоний-лиазы R. toruloides, происходит накопление белка с молекулярным ве­сом, близким к расчетному для PAL-6xHis, который равен 78,4 кДа (рис. 1). При этом в клетках кон­трольного штамма, не содержащего ген pal, такой белок отсутствует. Это позволяет сделать вывод о высокоэффективной экспрессии целевого гена. Кроме того, анализ клеточных фракций позволяет заключить, что белок практически полностью нахо­дится в растворимой форме.

 

 

Рис. 1. Экспрессия PAL в E. Сoli: М – маркеры молеку­лярного веса (Fermentas, cat. # SM0431); 1–4, BL21(DE3) pLysE CodonPlus RP/pET-28a: 1 – тотальный клеточный белок до индукции; 2 – тотальный клеточный белок через 24 ч после индукции; 3 – осветленный лизат клеток через 24 ч после индукции; 4 – нерастворимая фракция белка че­рез 24 ч после индукции; 5–8, BL21(DE3) pLysE CodonPlus RP/pETPAL-28a: 5 – тотальный клеточный белок до ин­дукции; 6 – тотальный клеточный белок через 24 ч после индукции; 7 – осветленный лизат клеток через 24 ч после индукции; 8 – нерастворимая фракция белка через 24 ч по­сле индукции; 9–12, Rozetta (DE3)/pETPAL-28a: 9 – то­тальный клеточный белок до индукции; 10 – тотальный клеточный белок через 24 ч после индукции; 11 – освет­ленный лизат клеток через 24 ч после индукции; 12 – не­растворимая фракция белка через 24 ч после индукции

 

В использованном в работе экспрессирующем векторе pET28a непосредственно за кодирующей по­следовательностью расположен участок, кодирую­щий гексагистидиновую последовательность. Таким образом, в результате индуцируемой экспрессии клонированного в нем гена pal синтезировалась L-фенилаланин-аммоний-лиаза, содержащая дополни­тельную гексагистидиновую последовательность в С-концевой области полипептидной цепи, позво­ляющую осуществлять аффинную чистку белка на Ni-NTA носителе.

Белок PAL-His эффективно связывается с Ni-NTA сорбентом и элюируется имидазолом (дорожки 4 и 9 на рис. 2).

 

 

Рис. 2. Очистка PAL из клеток E. Coli: М – маркеры молекулярного веса (Fermentas, cat. # SM0431); 1–5, BL21(DE3) pLysE CodonPlus RP/pETPAL-28a: 1 – освет­ленный лизат; 2 – проскок (фракция белков, не связав­шаяся с сорбентом); 3 – промывка буфером NPI-20;            4 – элюция буфером NPI-500; 5 – элюция буфером NP-ЭДТА; 6–10, Rozetta (DE3)/pETPAL-28a: 6 – осветленный лизат; 7 – проскок (фракция белков, не связавшаяся с сорбентом); 8 – промывка буфером NPI-20; 9 – элюция буфером NPI-500; 10 – элюция буфером NP-ЭДТА

 

Наличие остаточного белка PAL-His при элюции ЭДТА (дорожки 5 и 10), очевидно, обусловлено не­достаточным объемом элюирующего буфера NPI-500. Поскольку выход целевого белка по электрофо­ретической оценке выше из E. coli Rozetta (DE3), этот штамм является более перспективным для нара­ботки L-фенилаланин-аммоний-лиазы.

Благодаря наличию гексагистидиновой последо­вательности была достигнута высокая степень очи­стки (~90 %) рекомбинантной L-фенилаланин-аммо­ний-лиазы с помощью аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA носителем. Очищенный препарат обладал фенилаланин-аммоний-лиазной активно­стью.

Используемая в работе векторная конструкция показала свою высокую эффективность. Доля целе­вого белка, полученного после индукции, достигала в некоторых экспериментах 40 % суммарного белка клетки. Возможно, что при более тщательном под­боре условий индукции и культивирования рекомби­нантного штамма E. coli можно будет достигнуть и более высокого выхода целевого белка. Дополни­тельная гексагистидиновая последовательность по­зволила провести очистку фермента с сохранением его активности, при этом степень очистки составила более 90 %.

Таким образом, в настоящей работе синтезирован ген pal, кодирующий L-фенилаланин-аммоний-лиазу, выделенную из R. toruloides, который встроен в эффективную систему экспрессии. Полу­чен продуцент фермента с уровнем экспрессии после индукции до 40 % общего белка клетки. Поскольку полученный белок имеет His-Tag на С-конце, очи­стку проводили на колонке с Ni-NTA агарозой. Сте­пень очистки белка составила более 90 %.

 

References

1. Elektronnyy resurs: http://www.bioinformatix.ru/interesnoe/ryinok-fermentov-v-ozhidanii-peremen.html

2. Elektronnyy resurs: http://abercade.ru/research/industrynews/6059.html

3. Food-processing enzymes from recombinant microorganisms – a review / Z.S. Olempska-Beer, R.I. Merker, M.D. Ditto, et al // Regulatory toxicology and pharmacology. – 2006. – № 45. – P. 144–158.

4. Ahmad, S.K. Toxicological studies on lactose oxidase from Microdochium nivale expressed in Fusarium venenatum / S.K. Ahmad, D.S. Brinch, E.P. Friis // Regul. Toxicol. Pharmacol. – 2004. – № 39. – P. 256–270.

5. Determining the safety of maltogenic amylase produced by rDNA technology / J.R. Andersen, B.K. Diderichsen, R.K. Hjortkjaer, et al // J. Food Prot. – 1987. – № 50. – R. 521–526.

6. Van Beilen, J.B. Enzyme technology: an overview / J.B. Van Beilen, Z. Li // Curr. Opin. Biotechnol. – 2002. – № 13. – R. 338–344.

7. Barbesgaard, P. On the safety of Aspergillus oryzae: a review / P. Barbesgaard, H.P. Heldt-Hansen, B. Diderichsen // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1992. – № 36. – R. 569–572.

8. High level expression of recombinant genes in Aspergillus oryzae / T. Christensen, H. Woeldike, E. Boel, et al // Biotech-nology. – 1988. – № 6. – R. 1419–1422.

9. The safety assessment of novel foods. Guidelines prepared by ILSI Europe Novel Food Task Force / D.A. Jonas, E. Antignac, J.-M. Antoine, et al // Food Chem. Toxicol. – 1996. – № 34. – R. 931–940.

10. Roodveldt, C. Directed evolution of proteins for heterologous expression and stability / C. Roodveldt, A. Aharoni, D.S. Tawfik // Curr. Opin. Struct. Biol. – 2005. – № 15. – R. 50–56.

11. Purification, characterization, and heterologous expression in Fusarium venenatum of a novel serine carboxypeptidase from Aspergillus oryzae / A.M. Blinkovsky, T. Byun, K.M. Brown, et al // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – № 65. – R. 3298–3303.

12. The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis / F. Kunst, N. Ogasawara, I. Moszer, et al // Nature. – 1997. – № 390. – R. 249–256.

13. Cytotoxic potential of industrial strains of Bacillus sp. / P.B. Pedersen, M.E. Bjornvad, M.D. Rasmussen, et al // Regul. Toxicol. Pharmacol. – 2002. – № 36. – R. 155–161.

14. De Boer, A.S. On the industrial use of Bacillus licheniformis: a review / A.S. de Boer, F. Priest, B. Diderichsen // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1994. – № 40. – R. 595–598.

15. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12 / F.R. Blattner, et al // Science. – 1997. – № 277. – R. 1453–1462.

16. Human safety and genetically modified plants: a review of antibiotic resistance markers and future transformation selection technologies / D.A. Goldstein, B. Tinland, L.A. Gilbertson // J. Appl. Microbiol. – 2005. – № 99. – R. 7–23.

17. Keggins, K.M. Molegular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pUB110 / K.M. Keggins, P.S. Lovett, E.J. Duvall // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1978. – № 75. – R. 1423–1427.

18. The nucleotide sequence of pUB110: some salient features in relation to replication and its regulation / T. McKenzie, T. Hoshino, T. Tanaka, et al // Plasmid. – 1986. – № 15. – R. 93–103.

19. Schallmey, M. Developments in the use of Bacillus species for industrial production / M. Schallmey, A. Singh, O.P. Ward // Can. J. Microbiol. – 2004. – № 50. – R. 1–17.

20. Yanish-Perron, C. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors / C. Yanish-Perron, J. Vieira, J. Messing // Gene. – 1985. – № 33. – R. 103–119.

21. A novel, high performance enzyme for starch liquefaction. Discovery and optimization of a low pH, thermostable amylase / T.H. Richardson, X. Tan, G. Frey, et al // J. Biol. Chem. – 2002. – № 277. – R. 26501–26507.

22. Pariza, M.W. Evaluating the safety of microbial enzyme preparations used in food processing: update for a new century / M.W. Pariza, E.A. Johnson // Regul. Toxicol. Pharmacol. – 2001. – № 33. – R. 173–186.

23. Babich, O.O. Klonirovanie i ekspressiya gena L-fenilalanin-ammoniy-liazy i harakteristika produkta ego eks-pressii / O.O. Babich, L.S. Soldatova, A.Yu. Prosekov // Biotehnologiya. – 2011. – № 4. – S. 33–39.

24. Babich, O.O. Vydelenie, ochistka i nekotorye svoystva rekombinantnoy L-fenilalanin-ammoniy-liazy Rhodosporidium toruloides, ekspressirovannoy v kletkah E. soli / O.O. Babich, L.S. Soldatova, I.S. Razumnikova, A.Yu. Pro-sekov // Fundamental'nye issledovaniya. – 2011. – № 8. – S. 597–602.